課程基因芯片2006

基因芯片及其在細胞生物學中的應用周士新電話:828020031主要內(nèi)容1?；蛐酒母拍詈驮??；蛐酒念愋??；虮磉_的數(shù)據(jù)分析4。細胞生物學應用實例介紹21,基因芯片的概念和原理基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息,實質(zhì)是核酸堿基的互補匹配。把大量已知序列探針集成在同一個基片上，經(jīng)過標記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交。利用基因芯片雜交檢測圖像，可以對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析?；蛐酒軌蛟谕粫r間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測。3LabeledTargetHybridizedArrayDetectionReagentsDNAMicroarray基因芯片的原理4基因芯片的相關知識

5應用原則基因表達的微陣列應用最為廣泛是比較試驗為了提高實驗的可靠性，對于同一樣本，往往有兩次或更多次的重復實驗;由于DNA微陣列的費用較貴，不可能重復足夠多的次數(shù)來滿足實驗數(shù)據(jù)分析的要求良好的模型(除比較因素外,其他盡量相同)，時間點的選擇適當?shù)慕y(tǒng)計方法來分析數(shù)據(jù)62,基因芯片的類型探針制備方法：

1.cDNAarrays(Microspotting)cDNA芯片 2.Oligonucleotidearrays(Photolithographicsynthesis,Ink- jettechnology,etc.)寡核苷酸芯片探針位置:

基因表達芯片(geneexpressionmicroarray)

啟動子芯片(promotermicroarray)CHIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)onchip

外顯子（exons

microarray）

基因組芯片（Tilingmicroarray）

7基因芯片的類型探針用途：轉錄因子、免疫分子、細胞周期等腫瘤相關：Oncogene芯片、抑癌基因芯片microRNA芯片DNA甲基化芯片

8對遺傳過程的認識,2004ProteinhnRNADNAtr

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ntranslationMoleculeswitheffectorfunctiontRNArRNAreversetranscriptionmRNAsplicingribozymesmiRNAdicingpre-miRNAOthernoncodingRNAs9基因組序列基因表達譜蛋白質(zhì)譜mRNA編輯表觀遺傳機制轉錄過程染色質(zhì)的結構DNA甲基化轉錄因子表達譜轉錄因子結合序列的差異DNA結合RNA可變剪切MicroRNAs10Oligo(寡核苷核)芯片Oligo(寡核苷核)芯片介紹公司(美國Affymetrix)推動主要特點是超高密度核苷酸長度較短(=<60nt)11Affymetrix光脫保護合成法LampMaskChip12O

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GMaskSubstrateMaskSubstrateT–C–REPEATAffymetrix光脫保護合成法13Affymetrix光脫保護合成法Eachprobe25bplong11-20probespergenePerfectMatch(PM)aswellasMisMatch(MM)probes14Affymetrix基因表達芯片的探針設計5’3’mRNAsequencePerfectMatchMismatch15Affymetrix基因芯片流程SpecimensBioinformaticsLabeledTargets000016PMMMProbePairProbeCell:-24mmx24mm-3mm/Pixel-64PixelsAffymetrix探針設計17cDNAProbesGenBankUniGenedbESTcDNAArrays(~10,000Probes)RoboticPrintingcDNA基因芯片18ControlTestRT&LabeledwithFluorDyescDNAMicroarraysscanningCy3Cy5BioinformaticscDNA基因芯片樣品標記19cDNA基因芯片的熒光信號20Oligonucleotide芯片與cDNA芯片的比較OligonucleotideArrays

cDNAArraysHighdensity LowerdensityHighspecificity

Cross-hybridizationcannotbe determinedRequiressmallamountofsamples LargeramountofsamplesisrequiredGeneexpressionand MostlyforGeneExpressionGeneticalteration/polymorphismHighreagentcosts LowerreagentcostsHybridizationoftargetfromasinglesource Simultaneoushybridizationoftargets fromtwosourcesClonesforsignalvalidationhavetobe Clonesavailableforsignalvalidation

obtainedfromothersourcesDifficulttomanufacturearraysin-house

Arraymanufactureislaborintensive andinitialset-upisexpensiveHighcostperarray LowcostperarrayLowerflexibility Highflexibility21基因表達芯片cDNAArraysOligonucleotideArraysGlasArraysMembranebasedArrays22圖像分析網(wǎng)格Gridding:identifyspots(automatic,semiautomatic,manual)分割Segmentation:separatespotsfrombackground.Fixedcircle(B),AdaptivecircleC,Adaptiveshape(D),Histogram強度提取Intensityextraction:meanormedianofpixelsinspot背景修正Backgroundcorrection:localorglobal23啟動子芯片簡介染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation,ChIP）技術該技術的主要方法是：將細胞先用甲醛固定，使DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)，再用DNA結合蛋白（轉錄因子和核酸結合酶類）的特異性抗體將蛋白質(zhì)和DNA一起沉淀下來，與蛋白質(zhì)解離后的DNA經(jīng)過PCR擴增，并用熒光標記后，與芯片上的核酸探針雜交，通過雜交信號的檢測，判定該DNA結合蛋白與何種基因結合，由于DNA結合蛋白通常與基因的啟動子區(qū)結合，也稱為啟動子區(qū)基因芯片。

2425Tilingmicroarray簡介26Unbiased尋找轉錄因子的位點(TFBS)27Miskaetal.2005currentopinioningenetics

microRNA基因芯片簡介2829MicroarrayofmicroRNA30VisualizationofmiRNAarray313,基因芯片的數(shù)據(jù)分析DataProcessingDataMiningInformationDataKnowledge32數(shù)據(jù)處理NormalizationBackgroundSubtractionExpressionAlgorithmIntensityAlgorithmDataProcessing33基因表達數(shù)據(jù)分析過程強度算法(IntensityAlgorithm)將圖像轉化為雜交信號值背景去除(BackgroundSubtraction)

去除非特異性的雜交信號(背景信號)探針的對應算法(ExpressionAlgorithm)將探針的雜交信號值與各自所代表的基因相對應標準化(Normalization)不同試驗和不同樣品間數(shù)據(jù)的歸一化,使它們均衡可比34數(shù)據(jù)挖掘DataMiningGenesExperimentsNovelgenesNovelfunctionsofknowngenesPathwayelucidationsBiologicalProcesses123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.535主成分分析PrincipalComponentAnalysis(PCA)

分層聚類分析HierarchicalClusterAnalysis(HCA)

MultidimensionalScaling(MDS)

k-Means

ClassificationandRegressionTree(CART)

自組織映射Self-OrganizingMaps(SOM)

相關系數(shù)聚類CorrelationCoefficientClustering

向量機SupportVectorMachine(SVM)

k最近鄰法k-NearestNeighbors(KNN)

PartialLeast-SquaresRegression(PLS)

Back-PropagationArtificialNeuralNetwork(BP-ANN)

GeneticAlgorithm(GA)數(shù)據(jù)挖掘的方法介紹36a,hierarchicalclustering;b,Self-organizingmaps(SOMs)d,principalcomponentanalysis(PCA);e,nearest-neighborhoodmethod37LeukemiamelanomabreastcancercoloncancerScherfetal.NatureGenetics24:236-244(2000)

cDNAmicroarray9703cDNAprobes人類腫瘤的基因表達譜(PCA分析)38ResearchProjects分層聚類分析39Alizadehetal.,Nature403:503-11,2000404,基因芯片應用實例3.Extractmetylationpatternandinterpretresults41基因表達的時間性及空間性

(temporalandspatialspecificity)時間特異性