電子科大細(xì)胞生物學(xué)第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法概要了解細(xì)胞生物學(xué)常用研究方法，包括細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法、細(xì)胞組分分析方法、細(xì)胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)等。本章學(xué)習(xí)要求細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法細(xì)胞組分分析方法細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)本章主要教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

肉眼的分辨率：0.2mm；光鏡分辨率：0.2um；

EM分辨率可達(dá)到0.2nm1m=103mm=106um=109nm1、普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)

光鏡樣本制作：樣品經(jīng)過固定劑（如甲醛等）固定后包埋到包埋劑（如石蠟等）中，之后切成5um的薄片進(jìn)行觀察。觀察前一般要染色，如伊紅和美藍(lán)能特異結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)顯色；品紅特異顯示DNA所在部位。區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。分辨率2、熒光顯微鏡技術(shù)

原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

應(yīng)用：在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位。（FluorescenceMicroscopy）如:將標(biāo)記熒光素的純化肌動(dòng)蛋白顯微注射入培養(yǎng)細(xì)胞中，可以看到肌動(dòng)蛋白分子組裝成肌動(dòng)蛋白纖維。將可產(chǎn)生熒光的綠色熒光蛋白（GreenFluorescentProtein，GFP）基因與某種蛋白基因融合，在表達(dá)這種融合蛋白的細(xì)胞中，便可直接觀察到該蛋白的動(dòng)態(tài)變化。

（LaserScanningConfocalMicroscopy）物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一小點(diǎn)，彼此互相共聚焦。激光束（光源）經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)。從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光（樣3、激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

原理品一般經(jīng)免疫熒光標(biāo)記）經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測(cè)器檢出。通過樣品其他部位的激光即激光發(fā)出的熒光不會(huì)聚焦成像，因而檢測(cè)器不能檢出。排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用：4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenerrgytransfer,FRET）用于檢測(cè)活細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)分子之間的直接相互作用。供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊，且兩個(gè)探針距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí)，會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生FRET現(xiàn)象?？蛇x擇供體蛋白CFP和受體蛋白YFP分別與兩種目的蛋白融合表達(dá)。當(dāng)這兩個(gè)融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP所吸收，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光。此時(shí)可通過測(cè)量CFP熒光強(qiáng)度的損失量來確定這兩個(gè)蛋白是否相互作用。兩個(gè)蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測(cè)器所接收到的熒光越少。反之，不會(huì)產(chǎn)生FRET效應(yīng)。5、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP）該技術(shù)起源于20世紀(jì)70年代。使用與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)耦聯(lián)的親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等，檢測(cè)活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。高能量激光束照射使特定區(qū)域，該區(qū)域熒光會(huì)發(fā)生不可逆淬滅。光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)至光漂白區(qū)來完成。原理：

是研究膜蛋白或膜脂流動(dòng)性的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。

熒光素標(biāo)記膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射細(xì)胞表面某一區(qū)域，使被照射區(qū)的熒光淬滅變暗。由于膜的流動(dòng)性，淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加，最后恢復(fù)到與周圍的熒光強(qiáng)度相等。根據(jù)熒光恢復(fù)的速度可推算出膜蛋白或膜脂擴(kuò)散速度?？故蠹?xì)胞膜蛋白的熒光抗體（顯綠色熒光）和抗人紅細(xì)胞蛋白的熒光抗體（顯紅色熒光）分別標(biāo)記小鼠和人的細(xì)胞表面，然后用滅活的仙臺(tái)病毒處理使兩種細(xì)胞融合。10min后不同顏色的熒光在融合細(xì)胞表面開始擴(kuò)散，40min后已分辨不出融合細(xì)胞表面綠色熒光或紅色熒光區(qū)域。證明膜蛋白的流動(dòng)性二、電子顯微鏡技術(shù)透射電鏡（TEM）1)超薄切片技術(shù)2)負(fù)染色技術(shù)3)冰凍蝕刻技術(shù)4)真空噴鍍技術(shù)5)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

透射電鏡的基本構(gòu)造

透射電鏡主要制樣技術(shù)（1）透射電鏡基本構(gòu)造1、透射電鏡（TEM）

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200nm可見光玻璃透鏡不要求真空利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化100nm紫外光玻璃透鏡不要求真空TEM0.1nm電子束電磁透鏡要求真空（1.33x10-5～1.33x10-3Pa）利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差（2）電鏡與光鏡的比較

電子束穿透力很弱，很難通過細(xì)胞、組織切片，樣品須先制備超薄切片。

超薄切片厚度：40～50nm

制備程序：取材固定脫水浸透包埋切片染色觀察（3）透射電鏡主要制樣技術(shù)1）超薄切片技術(shù)用于透射電鏡（TEM）觀察樣本內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。

戊二醛：是一種化學(xué)交聯(lián)劑，滲透速率較四氧化鋨快，能固定蛋白和糖類（特別是糖原）。一般用戊二醛進(jìn)行前固定。但對(duì)大多數(shù)脂類的固定作用不強(qiáng)，樣品僅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化鋨進(jìn)行后固定。常用的固定劑：醛類固定劑、四氧化鋨等單一固定劑不能固定細(xì)胞內(nèi)所有組分，常需聯(lián)合使用不同固定劑。常采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定。

四氧化鋨：是一種重金屬化合物，能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，是膜結(jié)構(gòu)最佳固定劑。四氧化鋨在隨后的脫水過程中可被還原形成鋨黑，使樣品反差增強(qiáng)。但四氧化鋨滲透緩慢，對(duì)酶活性和抗原活性破壞較大。取材與固定固定好的樣品一般要經(jīng)過濃度遞增的乙醇或丙酮進(jìn)行脫水。脫水后將樣品包埋在樹脂中，使之獲得一定的硬度、彈性和韌度，這樣才易于切成超薄切片，并使切片能承受電子束轟擊。環(huán)氧樹脂：國(guó)產(chǎn)618環(huán)氧樹脂、Epon812等脫水包埋常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂和丙烯酸樹脂等丙烯酸樹脂：有LRWhite、LRGold、Lowi-crvls等超薄切片一般收集在金屬載網(wǎng)上進(jìn)行觀察。常用銅網(wǎng)為200～400目，此外根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求還可選用金網(wǎng)、鎳網(wǎng)等。載網(wǎng)上一般包被一層支持膜，以支撐載網(wǎng)上的超薄切片，增加其穩(wěn)定性。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉膠、碳等。包埋好的組織塊需在超薄切片機(jī)上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片。切片生物樣品多數(shù)是由碳、氫、氧、氮等元素組成的，這些元素的原子序數(shù)低，散射電子的能力不強(qiáng)，在電鏡下的反差非常弱，因此通常需用高分子量的金屬鹽來對(duì)超薄切片進(jìn)行染色，由于細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)對(duì)金屬鹽的親和力不同，因此染色后不同結(jié)構(gòu)對(duì)電子的散射能力亦不同，從而增強(qiáng)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反差。常用染色液:醋酸雙氧鈾和鉛染液電鏡觀察染色與觀察大鼠骨髓干細(xì)胞的超薄切片（引自G.M.Wrightetal）

染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).2）負(fù)染色技術(shù)常用染色劑：2％磷鎢酸水溶液（Negativestaining）家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片(病毒直徑20nm)（陳立華、翟中和）

制備過程簡(jiǎn)單，只需將樣品制成懸液，直接滴于載網(wǎng)上，然后用重金屬物質(zhì)染液染色。即可在EM下觀察。重金屬物質(zhì)散射電子的能力較樣品本身強(qiáng)，電鏡下兩者顯示出明顯的明暗對(duì)比，樣品呈亮色，而其周圍的背景將呈暗色，這樣樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)就被襯托出來。常用染色劑：2％磷鎢酸水溶液

真空噴鍍一般在噴鍍儀中進(jìn)行，將鉑、鉻、金等重金屬在高真空條件下加熱，使其蒸發(fā)，蒸發(fā)出來的金屬粒子以一定的角度斜向噴鍍于樣品表面，這樣凸出的樣品表面將比周圍背景優(yōu)先包被一層金屬薄膜，二者之間的反差加大，樣品輪廓清晰地顯示出來。

單方向噴鍍，樣品向著金屬發(fā)射源一面沉積金屬粒子較多，而背側(cè)面較少，形成投影。增強(qiáng)樣品反差，樣品富立體感。

旋轉(zhuǎn)噴鍍，可使樣品表面的金屬薄膜均勻一致。3）真空噴鍍技術(shù)a）快速冷凍b）低溫?cái)嗔裞）蝕刻d）復(fù)型主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。4）冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）樣品在低溫下迅速冷凍（液氮或液氦中）和低溫下，結(jié)構(gòu)“脆弱”部位（膜脂雙分子層疏水端）斷裂，顯示出膜脂中的蛋白質(zhì)顆粒，真空中冰升華，進(jìn)一步增強(qiáng)“浮雕”式蝕刻效果，鉑金噴鍍形成凹凸電子反差，真空噴鍍碳膜，樣品再經(jīng)消化液消化，收集復(fù)型膜在電鏡下觀察。2、掃描電鏡（SEM）CO2臨界點(diǎn)干燥法防止主要觀察樣品表面的形貌特征。

應(yīng)用

原理溫度以上使CO2以氣態(tài)形式逸去。

引起樣品變形的表面張力問題。常用液態(tài)CO2浸透樣品，然后在臨界成像立體感強(qiáng)，一般掃描電鏡分辨率為3nm。近年來研制的低壓高分辨掃描電鏡其分辨率可達(dá)0.7nm，可用于觀察核孔復(fù)合體等更精細(xì)結(jié)構(gòu)。瘧疾破壞的兩個(gè)紅細(xì)胞ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等。掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。

原理

裝置掃描的壓電陶瓷、逼近裝置、電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。三、掃描遂道顯微鏡1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）。2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息。3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

特點(diǎn)納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。

用途

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、離心分離技術(shù)用于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物。①破碎細(xì)胞：低滲勻漿、超聲波破碎、研磨等。②差速離心：利用不同離心速度分離密度不同的細(xì)胞組分。③密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離。

用途

基本操作過程二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特性，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

原理顯示DNA分布福爾根染色（FeulgenStain）酸水解可除去RNA，僅保留DNA，并除去DNA上的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露的自由醛基與schiff試劑反應(yīng)呈紫紅色。PAS反應(yīng)可確定多糖存在。原理是利用schiff試劑與醛基之間的反應(yīng)，但其醛基來自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用以證明脂肪滴存在。糖類顯色反應(yīng)脂類顯色反應(yīng)氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)呈紅色。檢測(cè)方法有多種氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸，形成有色復(fù)合物?？捎昧虼见}共價(jià)鍵的試劑進(jìn)行檢測(cè)。如檢測(cè)堿性磷酸酶可用格莫瑞（Gomori）方法。蛋白質(zhì)顯色反應(yīng)米倫（Millon）反應(yīng)重氮反應(yīng)蛋白質(zhì)-SH檢測(cè)酶檢測(cè)三、特異蛋白抗原的定位與定性快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。

免疫熒光技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)五、放射自顯影技術(shù)原理：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究。應(yīng)用：實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。

步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）；放射自顯影。鴨瘟病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，用3H－尿嘧啶核苷脈沖標(biāo)記10分鐘的電鏡放射自顯影圖片。在病毒大量復(fù)制與裝配的宿主細(xì)胞中，核仁（Nu）依然存在，并保持其轉(zhuǎn)錄功能

SG：

銀顆粒；

N：

細(xì)胞核；

Nu：

核仁；

C：

細(xì)胞質(zhì)。

六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microsp