PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)說(shuō)明分析

PCR試驗(yàn)室設(shè)計(jì)說(shuō)明PCR試驗(yàn)室分為四個(gè)區(qū)域，進(jìn)入各工作區(qū)域必需嚴(yán)格依據(jù)單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域運(yùn)用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區(qū)域時(shí),不得將工作服帶出，四區(qū)域分別為：.試劑配制區(qū)n.樣品處理區(qū)n.核酸擴(kuò)增區(qū)n.產(chǎn)物分析區(qū)n如運(yùn)用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并,三四區(qū)可合并為擴(kuò)增產(chǎn)物分析。各區(qū)的功能是：試劑打算區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存。樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定、結(jié)果分析、登記與報(bào)告。1.2擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)，須運(yùn)用不同的房間，兩區(qū)之間最好有肯定的間隔。1.3運(yùn)用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進(jìn)行少量試劑配制。4在滿意下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑打算區(qū)可設(shè)在同一房間內(nèi)：1在生物平安柜內(nèi)操作。每個(gè)試驗(yàn)人員、試驗(yàn)組分別運(yùn)用各自的試劑與耗材。盛放污染材料的器皿密封并一次性運(yùn)用。交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必需嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和打算區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各試驗(yàn)區(qū)之間的試劑與樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。PCR試驗(yàn)室平面布置示意圖如圖1所示。圖1PCR試驗(yàn)室平面布置示意圖3試驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與壓力限制PCR試驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避開(kāi)各個(gè)試驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采納全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格限制送、排風(fēng)的比例以保證各試驗(yàn)區(qū)的壓力要求。該試驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)干脆運(yùn)輸至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必需貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的限制，本區(qū)并沒(méi)有嚴(yán)格的要求。.2標(biāo)本制備區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存與其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员荛_(kāi)從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避開(kāi)在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來(lái)自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來(lái)自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必需打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危急性，其次次加樣必需在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避開(kāi)氣溶膠從本區(qū)漏出。為避開(kāi)氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量削減在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如運(yùn)用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避開(kāi)擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。4污染的預(yù)防與限制PCR試驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避開(kāi)污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；自然基因組DNA的污染；試劑的污染以與標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，試驗(yàn)就必需停止，直到找到污染源為止，而且試驗(yàn)結(jié)果必需作廢，需重新進(jìn)行試驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞試驗(yàn)室來(lái)找尋污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，奢侈人力物力。因此要避開(kāi)污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是解除。工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分(1)各個(gè)試驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；(2)各個(gè)試驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等),以避開(kāi)各個(gè)不同試驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。合理的系統(tǒng)設(shè)置(1)合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采納全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；(2)嚴(yán)格的氣流壓力限制，保證不同的試驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。.3規(guī)范的操作(1)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室的技術(shù)人員必需進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；(2)在試驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必需戴手套，并常常更換。止匕外，操作中運(yùn)用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；(3)清潔工作與時(shí)、正確。試驗(yàn)工作結(jié)束后，必需馬上對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照耀消毒外，對(duì)一些試驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。.4嚴(yán)格的管理(1)嚴(yán)格限制進(jìn)出試驗(yàn)室的人員。與試驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出試驗(yàn)室，有條件的狀況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)試驗(yàn)區(qū)的門；(2)在各個(gè)試驗(yàn)區(qū)域運(yùn)用帶有明顯區(qū)分標(biāo)記的工作服(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；(3)盡量削減在試驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以削減交叉污染的可能性。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液不能在試驗(yàn)室中傾倒，必需經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離試驗(yàn)室的地方棄掉，用過(guò)的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；(5)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特殊留意試驗(yàn)人員的平安防護(hù)。.5完備的試驗(yàn)室配套設(shè)施完備的試驗(yàn)室配套設(shè)施是保證明驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)依據(jù)各個(gè)試驗(yàn)室試驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。PCR試驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避開(kāi)各個(gè)試驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采納全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格限制送、排風(fēng)的比例以保證各試驗(yàn)區(qū)的壓力要求。3.1試劑貯存和打算區(qū)該試驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)干脆運(yùn)輸至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必需貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的限制，本區(qū)并沒(méi)有嚴(yán)格的要求。3.2標(biāo)本制備區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存與其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避開(kāi)從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避開(kāi)在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。3.3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。止匕外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來(lái)自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來(lái)自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必需打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危急性，其次次加樣必需在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避開(kāi)氣溶膠從本區(qū)漏出。為避開(kāi)氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量削減在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。3.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如運(yùn)用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避開(kāi)擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。4.0傳遞窗口的尺寸:一般傳遞窗規(guī)格：SAT500500x500x500（工作尺寸） SAT600600x600x600（X作尺寸）干凈傳遞窗規(guī)格：SAT600600x600x600（工作尺寸） SAT1000600x1000x600（工作尺寸）1.4.4用有效的方法對(duì)操作區(qū)域和共享器具在試驗(yàn)前后進(jìn)行清潔與消毒。設(shè)計(jì)要求：PCR試驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形式,現(xiàn)要主要是以組合形式為主流。完成一組PCR試驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物分析四個(gè)試驗(yàn)過(guò)程，若試驗(yàn)工藝須要，還應(yīng)增加樣品粉碎過(guò)程。一、分散形式PCR試驗(yàn)室所謂分散形式PCR試驗(yàn)室，是指完成上述試驗(yàn)過(guò)程的試驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。對(duì)于這種布置形式的PCR試驗(yàn)室，由于各個(gè)試驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無(wú)需特殊條件要求。二、組合形式PCR試驗(yàn)室所謂組合形式PCR試驗(yàn)室，是指完成PCR四個(gè)試驗(yàn)過(guò)程的試驗(yàn)用房相鄰布置，組成獨(dú)立試驗(yàn)區(qū)域的形式。對(duì)于組合形式PCR試驗(yàn)室，由于各個(gè)試驗(yàn)間集中布置，簡(jiǎn)單造成相互干擾，因此，對(duì)總體布局以與屏障系統(tǒng)具有肯定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以削減室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室與樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染,可以通過(guò)限制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。核酸擴(kuò)增室與產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，可以通過(guò)限制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。在志向狀況下，PCR試驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR試驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中心空調(diào)限制，要求將中心空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。假如運(yùn)用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。須要指出的是在削減室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個(gè)區(qū)域之間應(yīng)具備單向的試驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的愛(ài)護(hù)屏障，避開(kāi)試驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對(duì)試驗(yàn)過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。試驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)堅(jiān)固、氣密性好；全部陰角宜采納圓弧形線條過(guò)渡；墻體內(nèi)壁光滑、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿意無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光滑、耐腐蝕的要求。假如運(yùn)用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。須要指出的是在削減室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個(gè)區(qū)域之間應(yīng)具備單向的試驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的愛(ài)護(hù)屏障，避開(kāi)試驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對(duì)試驗(yàn)過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。試驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)堅(jiān)固、氣密性好；全部陰角宜采納圓弧形線條過(guò)渡；墻體內(nèi)壁光滑、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿意無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光滑、耐腐蝕的要求。主要設(shè)備試劑打算區(qū) 儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺(tái)、加樣器、混勻器、天平和離心機(jī)等，加樣器、天平除了要專用外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。 試劑分裝應(yīng)在超凈臺(tái)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)運(yùn)用分子生物學(xué)級(jí)的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測(cè)試劑的擴(kuò)增效果。標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要有生物平安柜、加樣器、離心機(jī)、溫育儀、混勻器等擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)的主要儀器是核酸擴(kuò)增儀、超凈臺(tái)、微量加樣器、離心機(jī)、可移動(dòng)紫外燈。擴(kuò)增儀需進(jìn)行校準(zhǔn)。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動(dòng)，停電對(duì)擴(kuò)增效果的影響。分析區(qū) 本區(qū)所運(yùn)用的儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱等干凈試驗(yàn)區(qū)的緩沖間部分面積不能超過(guò)主試驗(yàn)室的八分之一，這是有規(guī)定的.主體結(jié)構(gòu)：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)全部陰角、陽(yáng)角均采納鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決簡(jiǎn)單污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，線條簡(jiǎn)明，美觀大方，密封性好。標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)整：將PCR過(guò)程分成試劑打算、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分析四個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)整，使整個(gè)PCR試驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_(kāi)緩沖區(qū)I,緩沖區(qū)n和pcr擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在試驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。3、消毒：在三個(gè)試驗(yàn)區(qū)和三個(gè)緩沖區(qū)頂部以與傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑打算區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)試驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。4、不銹鋼傳遞窗：試劑和標(biāo)本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議運(yùn)用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。5、地面地面建議運(yùn)用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。6、照明燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。在建設(shè)的過(guò)程中應(yīng)留意：?規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。?嚴(yán)格依據(jù)規(guī)范科學(xué)設(shè)計(jì)的安裝流程。?安裝前須要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，志向狀態(tài)的空間尺寸樣本處理區(qū)三、工作區(qū)域與設(shè)備要求（一）試劑儲(chǔ)存和打算區(qū)1、2-8C和T5C冰箱2、混勻器3、微量加樣器（覆蓋1-LOOOul）4、移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）6、專用工作服和工作鞋7、專用辦公用品（二）標(biāo)本制備區(qū)1、2-8C冰箱、-20C或-80c冰箱2、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)3、混允器4、水浴箱或加熱模塊5、微量加樣器（覆蓋ITOOOul）6、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）7、生物平安柜8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）9、專用工作服和工作鞋10、專用辦公用品如需處理大分子DNA,應(yīng)具有超聲波水浴儀。（三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)1、核酸擴(kuò)增儀2、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）3、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）5、專用工作服和工作鞋6、專用辦公用品（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：1、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）2、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）4、專用工作服和工作鞋5、專用辦公用品5.人員和樣品的平安是由生物平安柜和定向氣流共同來(lái)保證。PCR試驗(yàn)室設(shè)計(jì)規(guī)程中規(guī)定人員和樣品必需單向流淌。即從“試劑打算區(qū)到樣品制備區(qū)，再?gòu)臉悠分苽渥呦驍U(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)”，肯定不能反向流淌，以辟免交叉污