色譜原理講解

高效液相色譜分析原理及流程2011-6-20中國(guó)化工儀器網(wǎng) 點(diǎn)擊：227高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程。通常所說(shuō)的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑（硅膠、氧化鋁等）。這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡(jiǎn)單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高。高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。近年來(lái)，在保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來(lái)分析測(cè)定。高效液相色譜分析原理（一） 高效液相色譜分析的流程由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（二） 高效液相色譜的分離過(guò)程同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(zhǎng)展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。高效液相色譜的類型（一）吸附色譜在吸附色譜中，樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的，強(qiáng)離子樣品是不適宜的。吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ)，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦邼舛鹊拇紩?huì)減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。（二） 分配色譜正相分配色譜正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。反相分配色譜這種方法目前應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。通過(guò)使用的流動(dòng)相是水一甲醇和水一乙腈，通過(guò)加入甲醇或乙腈的量的不同來(lái)調(diào)節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團(tuán)，需要在流動(dòng)相中加入鹽或調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值，例如，如果樣品有一個(gè)一COOH基團(tuán)，使流動(dòng)相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。這個(gè)方法叫離子抑止法，如果樣品有強(qiáng)離子基，有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當(dāng)抗衡離子以形成離子對(duì)的離子對(duì)法。在調(diào)節(jié)PH值中，保持PH值在填料說(shuō)明書手冊(cè)中所規(guī)定的范圍內(nèi)，大多數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當(dāng)加入鹽以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的PH值。（三） 離子交換色譜這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離子交換來(lái)分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽(yáng)離子交換和陰離子交換。離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中，流動(dòng)相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對(duì)保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因?yàn)槁然飼?huì)腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCI或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測(cè)量波長(zhǎng)有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當(dāng)檢測(cè)處在短波端的時(shí)候，用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。（四） 凝膠色譜凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來(lái)分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。因?yàn)樵跇悠分?，小尺寸的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒(méi)有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，叫做凝膠滲透色譜。凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過(guò)濾。凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography),簡(jiǎn)稱GPC。此一類的色譜，使用于有機(jī)性溶媒的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform等等。凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜(GelFiltrarionChromatography),簡(jiǎn)稱GFC。此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。凝膠的種類很多，按其原料來(lái)源可分為有機(jī)膠和無(wú)機(jī)膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強(qiáng)度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)它對(duì)溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。文章鏈接：中國(guó)化工儀器網(wǎng)/News/Detail/20103.html氣相色譜的原理當(dāng)載氣把被分析的氣態(tài)混合物帶進(jìn)裝有固定相的色譜柱時(shí)，由于各組分的分子與固定相分子間發(fā)生吸附、脫附或溶解、離子交換等物理化學(xué)過(guò)程，使各組分的分子在載氣和固定相的兩相間分配系數(shù)不一樣，經(jīng)反復(fù)多次分配，不同組分在色譜柱上移動(dòng)速度不一樣，經(jīng)過(guò)色譜柱后，各組分按先后次序流出色譜柱，使各組分得到完全分離。氣相色譜的特點(diǎn)分離效能高。一般填充柱有幾千塊理論塔板，而毛細(xì)管柱理論塔板達(dá)103-106，因而可以分析沸點(diǎn)相近的組分和十分復(fù)雜的混合物。例如60m長(zhǎng)的毛細(xì)管柱可將汽油含10個(gè)碳以內(nèi)的組分分離出240個(gè)色譜峰。選擇性高。氣相色譜法可以分離化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相近的化合物。例如多環(huán)芳烴的異構(gòu)體、二甲苯的三種異構(gòu)體等，用其它方法分離相當(dāng)困難，但氣相色譜法則比較輕易。高靈敏度。與氣相色譜儀配用的高靈敏檢測(cè)器對(duì)待測(cè)物的最低檢測(cè)質(zhì)量可達(dá)0.1-10pg或更低。因而適合于微量有機(jī)物分析，例如采用電子捕捉檢測(cè)器，可測(cè)0.1.pgY/-666。分析速度快。一次色譜分析短者幾秒鐘，長(zhǎng)者幾分鐘到幾十分鐘完成。特別是目前氣相色譜儀可由微處理機(jī)控制并配數(shù)字處理系統(tǒng)，速度就更快。樣品用量少。由于氣相色譜靈敏度高，需要的樣品極少，一般進(jìn)樣幾個(gè)微升即能完成分析。分離和檢測(cè)能一次完成，這也是氣相色譜的特點(diǎn)。其它的分析方法，如紫外、紅外、質(zhì)譜等均需純品，對(duì)混合物則需分步進(jìn)行分離和檢測(cè)。但是，氣相色譜法的應(yīng)用有其局限性。即只能測(cè)定單一物質(zhì)的量，不能測(cè)定某些同類物的總量；在進(jìn)行定性和定量分析時(shí)，需要被測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，而標(biāo)準(zhǔn)品往往不易獲得，這給定性鑒定帶來(lái)困難。氣相色譜常用的名詞、術(shù)語(yǔ)及定義⑴色譜圖樣品各組分經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)人檢測(cè)器，它們?cè)跈z測(cè)器中引起響應(yīng)并作為分離時(shí)間的函數(shù)被記錄下來(lái)，這樣一系列表示組分性質(zhì)、含量信號(hào)一時(shí)間曲線就是色譜圖。對(duì)于微分型的檢測(cè)器，信號(hào)近似于正態(tài)分布曲線，色譜峰面積正比于組分質(zhì)量。色譜圖是氣相色譜法定性、定量的依據(jù)，也是衡量?jī)x器好壞的依據(jù)。⑵基線在操縱條件下，只有純載氣經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)，記錄儀所記錄的檢測(cè)器輸出的信號(hào)一時(shí)間曲線為基線。理論上是一條直線，但在高靈敏度量程時(shí)，基線常有一定的噪聲和漂移。噪聲：基線在短暫時(shí)間的波動(dòng)，以波動(dòng)的峰值表示。噪聲大往往和基流高聯(lián)系在一起。漂移：基線在一段較長(zhǎng)時(shí)間（如幾十分鐘）內(nèi)緩慢改變。噪聲是疊加在漂移上同時(shí)表現(xiàn)出來(lái)。⑶色譜峰在操縱條件下，當(dāng)載氣帶著樣品組分經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器