結(jié)核桿菌實(shí)時(shí)熒光定量pcr快速檢測方法建立及應(yīng)用

中國農(nóng)學(xué)通報(bào)2010,26(10):1-ChineseAgriculturalScience結(jié)核桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCRCFP10S中圖分類號S855.9+ 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 2009-Abstract:AccordingtothesequenceoftheMycobacteriumtuberculosisCFP10genetoestablishedaSYBRGreenIreal-timePCRmethodthatcoulddetectMycobacteriumtuberculosisCFP10gene.DesignedandsynthesizedapairofCFP10geneprimertobuildpositivestandardsamplethatcontainingthesequenceoftherecombinantplasmid.Testresultsshowedthatagoodlinearrelationshipofthismethod,correlationcoefficientofthismethodreachedto0.997,thelowestdetectionthresholdofthismethodwas1×101copies/μLthathigher100timesthantheconventionalPCRmethod.ThemethodhashighsensitivityandstrongspecificandgoodrepeatabilitythatcanbeusedtodetectthepathogenofMycobacteriumtuberculosisandquantitativebcuosT）[10CFP10因組RD1區(qū)操縱子編碼的低分子量蛋白[2，只存在于CFP10作為抗原可以將結(jié)核病與結(jié)核分支桿菌感染

結(jié)核病疫情至關(guān)重要。熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR）增的同時(shí)實(shí)現(xiàn)模板的定量測定。熒光定量PCR包括熒光探針和SYBRGreen兩種方法，其中SYBRGreen對于易變異的病原具有更高的特異性和靈敏（2006DA33740院，E-ma：mr-0522@63com。com--·2 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)度[4。試驗(yàn)將構(gòu)建個(gè)包含結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv核酸5′端翻譯區(qū)的重組陽性質(zhì)粒，并運(yùn)用LightCycler(LC)基于SYBRGreenⅠ進(jìn)行FQ-PCR檢測，為結(jié)核桿菌CFP10基因的熒光定量快速檢測提供

程有限公司，SmartCyclerⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀為美國Cepheid公司。GenBankCFP10全序（NC-000962），Primer3.0軟件設(shè)計(jì)選擇5′端保守區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物288bpddH2O溶解為μmol/L-模板DNA表1P(游引物2做常規(guī)CR10×fr2.5μ10oLNTP08μ2各0.2μ，aqNA0.5μN(yùn)A2μLddHO添加至25μL。采用以下循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5n95℃5060℃3072℃303072℃延伸7nR產(chǎn)物于%瓊脂糖凝膠NA收產(chǎn)物-0℃儲存?zhèn)溆谩０碢-T載體說明書將目的DH5α感受態(tài)細(xì)R鑒定。對R實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)熒光曲線形態(tài)和PCR反應(yīng)最快的原則來確測定質(zhì)粒OD260nm和OD280nm值，OD260nm/OD280nm值在1.8~2.0的質(zhì)粒方可用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲后，將其10倍系列稀釋成含有1×1021×1031×104、建立25L量R反應(yīng)3步法在美國eped公司SarycerⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量R算機(jī)軟件根據(jù)定量標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增情況繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)熒光定量PCR將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成含有1×10~1×109模板進(jìn)行常規(guī)PCRreal-timePCR和常規(guī)PCR敏感性的差異。將提取的DNA，采用PCR方法擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的CFP10基因，結(jié)果得到約288bp的目的片段。PCR產(chǎn)物回收后與PGM-T載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒PGM-T-CFP10，然后將其轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。選取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定。進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定。證實(shí)成功構(gòu)建（見圖1）。用測定的重組質(zhì)粒序列與GenBank中的結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的CFP10基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果氨基酸序列同源性達(dá)100%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR析和電泳鑒定只有單產(chǎn)物、熒光信號強(qiáng)為標(biāo)準(zhǔn)，得M1200900700500M120090070050030000模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到檢測CFP10的擴(kuò)增曲線呈典型的S（PCR擴(kuò)增曲線的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖34。y=-0.302x+10.642，斜率為-0.302，接近-0.30Ct值呈現(xiàn)良好的r2達(dá)到0.997增產(chǎn)物形成單Tm值為88，無引物聚體及特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖1最佳反應(yīng)體系：20EvaGreen0.6μL，2PCRbufferforEvaGeen12.5μL，5μmol/L濃度的上下游引μLho板2.0μL。最終確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件：s95℃s60s72s4810倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（1×1021×1031×1041×101×1061×107copies/μL）圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

最低檢出限為1×10copies/μL（如圖PCR檢出的最低限為1×103copies/μL（如圖5）。表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR的敏感度高100倍。圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖4SYBRGreenIreal-timePCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR由圖6可見，不同來源的結(jié)核桿菌的擴(kuò)增結(jié)果呈典光定量PCR可用于來鑒別結(jié)核桿菌與其他常見桿菌 圖5常規(guī)PCR梯度稀釋圖6實(shí)時(shí)熒光定量PCR·4 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)圖7試驗(yàn)總共檢測了60份臨床樣本，其中RT-PCR陽培養(yǎng)結(jié)果致，圖7為部分樣品的檢測結(jié)果。內(nèi)結(jié)核桿菌感染的日益嚴(yán)重[6。全球有2000萬活300萬人死于結(jié)核，中國每年有12.7萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病成為危害人類健康的重要傳染病之。對結(jié)核分支桿菌的研究再度成為全球研究的熱點(diǎn)。CFP10的編碼基因Rv3874存在于結(jié)核分支桿菌RD1缺失的基因區(qū)域，RD1區(qū)僅存在于致病性分支桿菌包CFP10所具有的重要價(jià)值，因此可將CFP10作為診斷實(shí)時(shí)熒光定量R量等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷中的主要方法。SYBRenⅠ是種雙鏈DA雙鏈DA1000熒光信號的增加與R產(chǎn)物的增加完全同步[8，在實(shí)時(shí)熒光定量R對核酸的檢測和定量中廣泛應(yīng)用。其優(yōu)勢在于能監(jiān)測任何雙鏈NA試驗(yàn)根據(jù)CFP10基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并基于SYBRGreenⅠ熒

光染料的特點(diǎn)成功制作了檢測CFP10基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定了最佳讀板溫度。結(jié)果表明，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的線性關(guān)系很好，直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2達(dá)到0.997；敏感性很高，檢出下限達(dá)1×10copies/μL，比常規(guī)PCR敏感100倍；產(chǎn)物出現(xiàn)唯的特異性條帶，CFP10SYBRGreenⅠreal-timePCR檢測方法的成功建立，為快速檢測病原[]WordHeathOrganzatonGobatubercuosscontro:surveance,pannng,fnances[R]WHOReport,2006ArendSM,GeukA,vanMejgaardenKE,etaAntgencequvaenceofhumanT-ceresponsestoMycobacterumtubercuoss-specfcRD-encodedprotenantgensESAT-6andcutureftrateproten0andtomxturesofsynthetcpeptdes[J]InfectImmun,2000,68(6):334-曹曉慧,張媛媛,PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J]中國人獸共患病雜志,2005,2(2):0-2ChungWB,ChanWH,ChaungHC,etaRea-tmePCRforquanttatonofporcnereproductveandrespratorysyndromevrusandporcnecrcovrustypennaturay-nfectedandchaengedpgs[J]JournaofVroogcaMethods,2005,24(-2):-YangZZ,HabbM,ShuaJB,etaDetectonofPCVDNAbySYBRGreenI-basedquanttatvePCR[J]JZhejangUnvScB,2007,8(3):62-69[J]中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,200,GordonSV,BroschR,BautA,etaIdentfcatonofvaraberegonsnthegenomesoftubercebacusngbacter