腫瘤分子標(biāo)記物檢測(cè)

腫瘤分子標(biāo)記物檢測(cè)隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活方式的改變，老齡化趨勢(shì)越來越明顯，惡性腫瘤已成為我國(guó)重要的健康問題，是我國(guó)男性的頭號(hào)殺手，在女性中僅次于心臟病和腦血管疾病。近年來，腫瘤藥物治療得到長(zhǎng)足發(fā)展，臨床醫(yī)生根據(jù)指南以及藥物的臨床試驗(yàn)，對(duì)腫瘤患者采用標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案，但其有敏感率低，超過半數(shù)的腫瘤患者出現(xiàn)耐藥，而且大部分起初有反應(yīng)者最終也出現(xiàn)耐藥，不僅給病人造成巨大的浪費(fèi)，也延誤了腫瘤的治療時(shí)機(jī)。得益于高通量分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用，藥物基因組學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)研究迅猛發(fā)展，對(duì)于腫瘤多成因、異質(zhì)性的特點(diǎn)有了更加全面的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為我們從惡性腫瘤的綜合治療由標(biāo)準(zhǔn)化過度到個(gè)性化指明了方向。個(gè)體化治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療最有效的手段，但如何識(shí)別具有相同腫瘤發(fā)生部位、相同病理類型及病期的不同患者之間存在的差異成為實(shí)施個(gè)體化治療的主要障礙。大量的臨床研究和試驗(yàn)結(jié)果表明：特異腫瘤分子標(biāo)記物是識(shí)別患者個(gè)體差異的重要依據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)這些分子標(biāo)記物的檢測(cè)是實(shí)施腫瘤個(gè)體化治療的前提和基礎(chǔ)。用于識(shí)別腫瘤患者個(gè)體差異的分子標(biāo)記物大致可歸納為三類：1）抗腫瘤藥物的作用分子標(biāo)記物，如HER2和EGFR；2）抗腫瘤藥物代謝相關(guān)的分子標(biāo)記物，如UGT1A1和CYP2D6等基因多態(tài)性；3）抗腫瘤藥物作用通路的相關(guān)分子標(biāo)記物，如KRAS基因突變和ERCC1基因mRNA表達(dá)水平。越來越多的證據(jù)顯示，抗腫瘤藥物作用通路的相關(guān)分子標(biāo)記物是識(shí)別患者個(gè)體差異的最主要分子標(biāo)記物。例如，約百分之三十?dāng)y帶了EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者使用針對(duì)EGFR的TKI藥物無效，其原因之一是患者存在其他分子標(biāo)記物的改變;再如，KRAS基因野生型的腸癌患者接受抗EGFR抗體藥物單藥治療療效仍然有限，也是因?yàn)槠渌肿訕?biāo)記物的變化，如BRAF基因激活突變。隨著抗腫瘤藥物的不斷增加以及研究的深入，與作用通路有關(guān)的分子標(biāo)記物越來越多。檢測(cè)也從以前的單一分子標(biāo)記物發(fā)展為多分子標(biāo)記物聯(lián)合進(jìn)行。通過針對(duì)不同癌種的系統(tǒng)分子標(biāo)記物檢測(cè)，篩選適合患者個(gè)體的藥物，提高治療的針對(duì)性和有效率。腫瘤治療能否真正實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化”，最終還要依賴于分子標(biāo)記物檢測(cè)的結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠。如何確保分子標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠是目前實(shí)施腫瘤個(gè)體化治療面臨的最大挑戰(zhàn)。根據(jù)分子標(biāo)記物的不同可將主要的檢測(cè)分為兩大類：一、體細(xì)胞突變和基因多態(tài)性體細(xì)胞突變?nèi)梭w正常細(xì)胞經(jīng)過一系列基因突變，最終擺脫細(xì)胞正常生長(zhǎng)調(diào)控而癌變。這些體細(xì)胞突變除了與腫瘤細(xì)胞惡性程度、侵襲性等特征有關(guān)外，部分體細(xì)胞突變會(huì)影響藥物療效，如上文及的腫瘤細(xì)胞EGFR基因突變基因多態(tài)性個(gè)體間基因組差異至少在15%，正是這種差異造成了不同個(gè)體間生物學(xué)性狀、疾病易感性、藥物效應(yīng)個(gè)體差異。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。其主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，并藉此改變基因的表達(dá)、翻譯和蛋白質(zhì)功能，從而產(chǎn)生對(duì)疾病易感或藥物效應(yīng)差異的表型。SNP已成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。借助于遺傳變異，理論上我們可以預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)某一藥物的反應(yīng)，但由于涉及到藥物劑量最優(yōu)化、降低毒副作用、提高療效和降低成本等因素的影響，這種預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較為相對(duì)。藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶體等功能性基因的SNP均會(huì)影響藥物的療效。如：5-FU是目前腸道等惡性腫瘤的基本化療藥物之一，臨床應(yīng)用較廣。已知二氫嘧啶脫氫酶基因（dihydropyrimidinedehydrogenasegene，DPYD）編碼5-FU代謝限速酶二氫嘧啶脫氫酶（Dihydropyrimidinedehydrogenaseenzyme，DPD）。但DPYD缺陷性等位基因造成DPD酶活性完全缺失，無法代謝5-FU，故當(dāng)使用5-FU時(shí)毒副作用會(huì)較大，甚至危及生命。腫瘤組織體細(xì)胞突變涉及染色體核型、基因擴(kuò)增、基因缺失、點(diǎn)突變等。對(duì)于基因擴(kuò)增或缺失，目前臨床上常使用FISH技術(shù)。而對(duì)于更大的染色體改變，可直接用傳統(tǒng)的核型分析即可。對(duì)于短片段突變（包括SNP）檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是測(cè)序，相較于mRNA和蛋白檢測(cè)方法，測(cè)序更為簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。另一方面，除了基因擴(kuò)增和缺失外，所有SNP/突變不涉及量的改變，因此其檢測(cè)結(jié)果可真實(shí)反映患者或其腫瘤組織的遺傳本質(zhì)。二、組織mRNA和蛋白表達(dá)惡性腫瘤的治療效果不僅跟患者本身的遺傳背景相關(guān)，而且與腫瘤組織的遺傳學(xué)改變（體細(xì)胞突變）密切相關(guān)。盡管發(fā)現(xiàn)了眾多的腫瘤遺傳學(xué)改變，事實(shí)上目前只有少部分的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于腫瘤的分子分型和治療（如EGFR突變）。腫瘤組織體細(xì)胞突變，最終會(huì)導(dǎo)致其基因/蛋白表達(dá)水平的異常改變。因此盡管對(duì)于這些遺傳學(xué)改變功能不明確，我們?nèi)钥赏ㄟ^基因/蛋白表達(dá)水平來獲得腫瘤組織的生物學(xué)信息。目前腫瘤組織基因/蛋白表達(dá)已開始應(yīng)用于臨床實(shí)踐。如：在最近發(fā)布的美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟（NCCN）非小細(xì)胞肺癌的臨床治療指南（第二版，2009）中明確指出：“在接受鉑類化療前進(jìn)行ERCC1mRNA表達(dá)水平檢測(cè)可提高治療有效率和患者生存率”；與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)的基因表達(dá)譜預(yù)測(cè)標(biāo)記物已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床。1.蛋白表達(dá)與免疫組化（IHC）腫瘤組織蛋白表達(dá)水平，目前臨床上多采用IHC技術(shù)。IHC法是用應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。盡管IHC是一個(gè)常規(guī)的很簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)，但由于涉及的實(shí)驗(yàn)步驟較多，其中任何一個(gè)步驟操作不當(dāng)，均會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。美國(guó)有一項(xiàng)調(diào)查顯示，IHC檢測(cè)HER2蛋白過表達(dá)的錯(cuò)誤陽性率平均為18%，而FISH檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的錯(cuò)誤率在13%。影響IHC結(jié)果準(zhǔn)確性的最大因素在于試驗(yàn)前期的各項(xiàng)工作，其中最為重要的影響因素是固定，而病理學(xué)家往往忽略了標(biāo)本的固定方式和固定時(shí)間的重要性。并且對(duì)于特定檢測(cè)項(xiàng)目年檢測(cè)數(shù)量也會(huì)影響IHC結(jié)果的準(zhǔn)確性，如果每年檢測(cè)數(shù)量很低，那么就不能保證結(jié)果的可靠性。同時(shí)，IHC另一個(gè)最大的缺陷是實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)。2.mRNA表達(dá)與定量PCR腫瘤組織基因mRNA表達(dá)水平，多利用定量PCR，該技術(shù)能精確地反映受檢基因在腫瘤組織中的表達(dá)水平，從而能精確地評(píng)估腫瘤的相關(guān)信息。定量PCR目前已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。相對(duì)于蛋白水平的免疫組化而言，它體現(xiàn)出的是更真實(shí)的體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)量的信息，并且檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性更高。由于mRNA極易降解，對(duì)于樣本處理要求很高。綜上所述，以基因多態(tài)性/突變檢測(cè)結(jié)果最為準(zhǔn)確，免疫