簡并引物設(shè)計方法

【心得】簡并引物設(shè)計方法（實際操作步驟）自己做過一些簡并引物，現(xiàn)將我利用生物信息學(xué)資源設(shè)計簡并引物的各個步驟作一個總結(jié)，各位戰(zhàn)友可將各自的心得體會寫下，以便大家交流?。。∫?、 利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因為密碼子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，杳找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp（誦過蛋白杳蛋白），在整個Nr數(shù)據(jù)庫中中杳找與之相似的氨基酸序列。二、 對所找到的序列進行多序列比對將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進彳〒多序列比對，可選工具有ClustalW，也可在線分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其結(jié)果入下圖所示，所有序歹||的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。（縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖）三、 確定合適的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50?400個aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對?？傊?，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。四、 利用軟件設(shè)計引物當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了，其中pp5支持簡并引物的設(shè)計（關(guān)于其的使用請見筆者的另一個帖子/bbs/post/iew?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T），該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會有數(shù)對，分數(shù)越高越好。五、 對引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則其簡并度=4x2x4x3x4x3x2=2304,很明顯該條引物的簡并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌吟代替N（因為次黃嘌吟能很好的和4種堿基配對）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度（有個查密碼子偏好的數(shù)據(jù)庫我以前發(fā)過大家搜索一下把）。最后，這樣子設(shè)計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。謝謝，很好!!樓主您好！請多指點！我要用質(zhì)譜得到的兩個肽段設(shè)計簡并引物和探針：一、 序列肽段1：AHGFLPLTK(9肽)肽段2：ATGGSAL(7肽)-本應(yīng)19肽，取可信度最高的7個氨基酸二、 用PrimerPremier5設(shè)計的簡并引物：肽段1S5'GCNCAYGGNTTYYTNCCNYTNCANATm70.4A3'CGNGTRCCNAARANGGGNRANTGNTGC%52肽段2S5'GCNACNGGNGGNWSNGCNYTTm73.4A3'CGNTGNCCNCCNWSNCGNRAGC%66.7三、 請問：1、 每個N都用次黃嘌吟代替嗎？2、 直接用物種偏好密碼子替代多義堿基嗎？這是該物種的偏好密碼子表：AminoAcidsCodons123456[color=black]AAlaAlanineGCC(61.8)GCG(38.0)GCA(16.5)GCU(10.1)CCysCysteineUGC(6.9)UGU(1.7)DAspAsparticacidGAC(35.7)GAU(19.6)EGluGlutamicacidGAA(26.5)GAG(25.7)FPhePhenylalanineUUC(27.7)UUU(4.6)GGlyGlycineGGC(54.8)GGU(15.3)GGG(7.9)GGA(5.6)HHisHistidineCAC(13.7)CAU(6.6)IlleIsoleucineAUC(36.6)AUU(6.6)AUA(1.8)KLysLysineAAG(30.2)AAA(7.1)LLeuLeucineCUG(67.3)CUC(12.5)UUG(7.7)CUU(5.8)CUA(1.7)UUA(1.6)MMetMethionineAUG(25.3)NAsnAsparagineAAC(23.4)AAU(6.2)PProProlineCCG(31.4)CCC(10.2)CCA(4.9)CCU(3.0)QGlnGlutamineCAG(36.7)CAA(5.3)RArgArginineCGC(36.8)CGU(10.7)CGG(10.3)CGA(4.1)AGG(2.6)AGA(1.5)SSerSerineAGC(21.7)UCG(15.2)UCC(10.7)AGU(4.4)UCU(2.5)UCA(2.4)TThrThreonineACC(38.6)ACG(12.0)ACU(3.5)ACA(3.3)alalineGUG(41.9)GUC(22.4)GUU(7.9)GUA(6.2)WTrpTryptophanUGG(12.4)YTyrTyrosineUAC(16.3)UAU(5.9)STOPUGA(1.9)UAA(0.6)UAG(0.3請您幫忙看一下好嗎？發(fā)帖好幾天了無人應(yīng)助。。導(dǎo)師和同學(xué)也都不作這個。?？煊魫炈懒?！在線等！1、 次黃嘌吟的優(yōu)點是能和四種堿基很好地配對，并且不降低引物可結(jié)合的靶序列的數(shù)目。不過次黃嘌吟的價格比較貴，可能要一百一個,如果錢多也無所謂啊，哈哈。2、 每一個aa對應(yīng)的密碼子都有一個出現(xiàn)的頻率，根據(jù)你研究的物種的Ala對應(yīng)有4種可能的密碼子GCC(61.8)GCG(38.0)GCA(16.5)GCU(10.1)，根據(jù)每個密碼子出現(xiàn)的頻率你可以先從高的試起，比如Ala可以設(shè)計為GC(CG)，可能繪出很多條帶，可以都割了區(qū)測序，關(guān)鍵要多是幾次。實在不行建議以亞套方式合成引物庫，可以參考《PCR技術(shù)實驗指南》，科學(xué)出版社和張學(xué)敏《靶向新基因的克隆策田一理論與方法》軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社祝實驗順利??！衷心感謝qxkillgre的及時解答。請斑竹加分！次黃嘌吟全部替代不現(xiàn)實阿。若選擇性替代N是盡量靠近3'端還是5'端？手動設(shè)計后怎么對其進行評價和Blast？很多軟件只提供特異性引物的評估。查到了該物種的基因組序列。兩個肽段的BLAST都與該物種的一假設(shè)蛋白同源(盡管得分很低)，是否可以利用這一信息進行嘗試？用偏好密碼子替代G+C含量偏高。據(jù)您的經(jīng)驗，哪家公司的簡并引物和探針合成較好？加您的qq或msn行嗎？郵箱也行。設(shè)計好后想請您審核一下。1、 I一般替代在3'端，保證了3'引物和模板的結(jié)合才能保證pcr的進行。2、 看看兩條引物的3'端有沒有互補就行了，你只是要求出帶，又不要圖片多好看是發(fā)3、 不知道你是基于數(shù)目判定他們同源的，如果確實同源肯定要試一試啊4、 gc高可以嘗試tdpcr啊5、 我是在生工合成的祝實驗順利??！樓主，是不是在只知道蛋白質(zhì)序列或者是氨基酸序列的時候，應(yīng)用簡并引物設(shè)計??？我要做的東西，只在論文上查到了蛋白質(zhì)序列，卻沒有基因序列。郁悶中，為什么會這樣??？我們本來打算先用文獻公布的引物，先P出來，然后測序，根據(jù)序列再看是不是需要繼續(xù)p,可是看到這個帖子，就想問問，是不是可以用簡并引物做，謝謝??！大家好，有誰能告訴我如何查找目的基因和引物?謝謝！winy9951533wrote:樓主，是不是在只知道蛋白質(zhì)序列或者是氨基酸序列的時候，應(yīng)用簡并引物設(shè)計??？我要做的東西，只在論文上查到了蛋白質(zhì)序列，卻沒有基因序列。郁悶中，為什么會這樣??？我們本來打算先用文獻公布的引物，先P出來，然后測序，根據(jù)序列再看是不是需要繼續(xù)p,可是看到這個帖子，就想問問，是不是可以用簡并引物做，謝謝??！人家有引物先試一試啊很好?。?！我來做過兼并引物的設(shè)計，談點粗淺的看法，并推薦個比較好的方法。由于引物的簡并性的問題，所設(shè)計的引物通常簡并性過高，導(dǎo)致有效引物利用率降低，PCR產(chǎn)物非特異性增高。雖然減少簡并引物長度可以相對減少簡并性，但隨之而來的問題是引物的Tm值過低，有時不得不設(shè)計第二對引物對PCR產(chǎn)物進行二次擴增，即巢式PCR，或者需要與TouchdownPCR相結(jié)合使用。與通常設(shè)計的簡并引物不同，利用CodeHop方法設(shè)計簡并引物。引物由兩部分組成：引物3'端為根據(jù)4-5個保守氨基酸設(shè)計的核心簡并區(qū)O'coreregion)，長度只有11-15個堿基；引物5'端為非簡并性夾板結(jié)構(gòu)(5'consensusclampregion)。5'端夾板結(jié)構(gòu)是根據(jù)密碼子偏向性設(shè)計的一致性序列，它最大程度的預(yù)測了保守性氨基酸的編碼序列，其長度取決于所需的退火溫度。這樣設(shè)計的優(yōu)點在于既減少了引物的簡并度，又提高了引物的退火溫度，保障了PCR產(chǎn)物的特異性。標準簡并PCR在聚合反應(yīng)的晚期，隨著產(chǎn)物的增多，引物的非特異性結(jié)合的現(xiàn)象增多；而CodeHopPCR的晚期，這種現(xiàn)象大為減少。實驗結(jié)果表明，按這種方法設(shè)計的簡并引物非特異性擴增減少，是一種快捷方便的簡并引物設(shè)計方案。其與標準的簡并PCR比較見圖。關(guān)于CODEHOP方法，可參見文獻TimothyMR,EmiliRS,JorjaGH,etal.Consensus-degeneratehybridoligonucleotideprimersforamplicationofdistantlyrelatedsequenes[J].NucleciAcidsReseach,1998,26(7):1628RoseTM,HenikoffJG,HenikoffS.CODEHOP(COns