培養(yǎng)細(xì)胞之死活細(xì)胞的鑒別實驗報告

1/5生物化學(xué)實驗報告姓名于佳喜姓名于佳喜學(xué)號201300140120學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院年級2013級生物基地班一、實驗?zāi)康?.1學(xué)習(xí)并掌握動物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。

1.2了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細(xì)胞培養(yǎng)法進行動物細(xì)胞原代培養(yǎng)的實驗方法。

1.3熟練掌握動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實驗方法。1.4學(xué)習(xí)細(xì)胞生死狀態(tài)鑒別的方法。1.5了解細(xì)胞生死狀態(tài)鑒別的原理。

1.6熟悉和掌握各種鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)方法的判定特征。

1.7掌握細(xì)胞技術(shù)方法，計算細(xì)胞存活率二、實驗原理細(xì)胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細(xì)胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使離體的細(xì)胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學(xué)染色法和熒光染色法。

活細(xì)胞和死亡細(xì)胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在一下差異：①

細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對細(xì)胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過；而細(xì)胞死后，細(xì)胞膜受損，其通透性增加?；诖耍l(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。此外，應(yīng)用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細(xì)胞的生死狀態(tài)。活細(xì)胞的原生質(zhì)具有選擇透過性，死細(xì)胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。②

代謝上的差異：活細(xì)胞中新陳代謝作用強，細(xì)胞內(nèi)的酶具有較強的活性和還原能力?；诖?，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細(xì)胞吸收進入，活細(xì)胞內(nèi)的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細(xì)胞膜，積累在細(xì)胞內(nèi)，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細(xì)胞內(nèi)的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細(xì)胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色?；罴?xì)胞因具有較強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細(xì)胞在用亞甲基藍染色后顯示無色；死亡酵母細(xì)胞或代謝緩慢的衰老酵母細(xì)胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色。三、實驗器材3.1

器材：解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、紗布塊、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、L型注射器、離心管等。上述器材需徹底洗凈、烤干、包裝好，滅菌，備用。

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、普通光學(xué)顯微鏡、離心機、血球計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、解剖板、蓋玻片等。

3.2試劑：培養(yǎng)液、PBS液

0.4%臺盼藍染液3.3材料：小白鼠四、操作步驟4.

1取材

取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1—2次。轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。

4.2

分離脾細(xì)胞

4.2.1用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾長軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細(xì)胞散開）。

4.2.2用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細(xì)胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細(xì)胞，稍傾斜并靜置1—2分鐘。

4.2.3吸取上述靜置后的脾細(xì)胞懸液上清部分放入Eppendorf發(fā)管，并使量至1ml，以3000r/分離1—2分鐘。

4.3

培養(yǎng)脾細(xì)胞

4.3.1超凈工作臺中取塑料培養(yǎng)皿一個，用移液槍（1000μl）加入細(xì)胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上標(biāo)記，待用。4.3.2

取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內(nèi)開蓋棄去上清液，用移液槍（200μl）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，然后吸取200ml脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.4

臺盼藍法鑒定細(xì)胞的生死狀態(tài)：

4.4.1試劑配制：用生理鹽水配置0.4%臺盼藍染液，備用。4.4.2染色計數(shù)：取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少許染色后的細(xì)胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10倍物鏡下計數(shù)四個大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。

4.4.3根據(jù)染色結(jié)果計算活細(xì)胞率：依據(jù)死細(xì)胞染成藍色、活細(xì)胞不著色的原則計數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以如下公式計算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-死亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)

*100%4.5關(guān)于血球計數(shù)板

4.5.1血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個半邊上面各有有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九大格，其中間的一大格（又稱計數(shù)室）常被用作細(xì)胞的計數(shù)。

計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格,而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，他們都有一個共同特點，即每個大方格都有400個小方格組成。

圖1血球計數(shù)板的構(gòu)造(a、平面圖；b、側(cè)面圖)圖2血球計數(shù)板網(wǎng)格的分區(qū)和分格每個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400mm2,蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3，所以每個小方格的體積為1/400mm3若取四個大方格的細(xì)胞數(shù)，則：

每毫升液體中細(xì)胞的數(shù)=每個大方格中的細(xì)胞數(shù)量*10000*稀釋倍數(shù)4.5.2此次實驗中，使用的是前一種血球計數(shù)板，因此分別選取左上、左下、右上、右下四個中方格進行計數(shù)。五、注意事項5.1在進行方格查數(shù)時注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)下不數(shù)上。

5.2

實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到皮膚上。

5.3動物細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒或除菌處理，才能進超凈工作臺中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，避免細(xì)胞被污染。

5.4在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈后，實驗操作應(yīng)在火焰的附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過培養(yǎng)液的用具不能長時間燒灼，以免燒焦形成碳膜。

5.5超凈工作臺內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。

5.6在超凈工作臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發(fā)和pH變化。

5.7

器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細(xì)胞污染或溶液漏出。六、實驗結(jié)果取樣位置左上左下右上右下活細(xì)胞數(shù)27333537死細(xì)胞數(shù)78618980細(xì)胞總數(shù)10594124117每大格細(xì)胞總數(shù)平均值為110，每大格平均死亡細(xì)胞數(shù)為77每毫升溶液中細(xì)胞總數(shù)=110*10000*2=2.2*106個細(xì)胞存活率=（110-77）/110*100%=30.0%七、分析與討論7.1實驗數(shù)據(jù)討論此次實驗，我組測得細(xì)胞存活率為30.0%，經(jīng)過交流，有些組的細(xì)胞存活率達到44.6%，分析存活率相對較低的原因如下：7.1.1無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會影響觀察，導(dǎo)致實驗失?。?/p>

7.1.2在離心分離呈單細(xì)胞的過程中離心機轉(zhuǎn)速過快或時間過長很可能會導(dǎo)致細(xì)胞破裂，導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞大量死亡；

7.1.3染色時間過長，或觀察時間過長都會導(dǎo)致染色試劑將細(xì)胞殺死，使細(xì)胞活力驟降，這是導(dǎo)致細(xì)胞活力比較低的重要原因；

7.1.4實驗中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計算帶來的誤差等也會直接導(dǎo)致實驗誤差。

7.1.5取液時沒有搖勻細(xì)胞液，導(dǎo)致取液不均勻。7.1.6培養(yǎng)時間過長，養(yǎng)分耗盡。7.2關(guān)于支原體污染此次實驗中，有同學(xué)培養(yǎng)的細(xì)胞被真菌污染，細(xì)胞被細(xì)菌或真菌污染時很容易檢測和預(yù)防，而因為它極小，直徑在0.2-2

μm，可以輕松地通過濾膜，混入培養(yǎng)系統(tǒng)中；而且它沒有剛性的細(xì)胞壁，因此普通的抗生素對它根本不起作用?；谝陨蟽牲c，它即使生長到很高密度，也沒有明顯的污染跡象。細(xì)胞培養(yǎng)，特別是傳代細(xì)胞，被支原體污染是個世界性問題。有研究報告稱25%的細(xì)胞都存在支原體污染。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。支原體污染后，因為它們不會使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染，等等。此次細(xì)胞培養(yǎng)實驗幾乎全部都是在無菌條件下進行，培養(yǎng)基和器材都保證無菌，并對實驗操作進行了嚴(yán)格規(guī)范，基本能夠保證避免支原體污染。課后作業(yè)1.抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物的篩選方法1.1MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT噻唑藍為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測定490nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。步驟：a)接種細(xì)胞用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。b)培養(yǎng)細(xì)胞同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天(可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間)。c)呈色培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。d)比色選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。1.2NCI所用的體外化療藥物篩選法簡單地說，NCI的體外化療藥物篩選系統(tǒng)由60種不同的人體腫瘤細(xì)胞株組成，測定每個受試化合物在一定濃度范圍抑止各腫瘤細(xì)胞的生長的能力或細(xì)胞毒性程度。以常規(guī)采用的篩選試驗為例，在實驗開始前一天，所有60種腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞先接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后將受試化合物10倍梯度稀釋，一般最高濃度采用10－4mol。每種化合物試驗5種不同濃度。樣品加入細(xì)胞懸液后培育48小時。此后用細(xì)胞染色法測定細(xì)胞的生長曲線，用sulforhodamine染色，再測定吸光度用以估計細(xì)胞數(shù)目。根據(jù)比色結(jié)果畫出60條劑量一反應(yīng)曲線，然后計算出50％生長抑止?jié)舛?GI50)，100％生長抑止?jié)舛?TGI)以及50％細(xì)胞死亡濃度(LC50)。再將各細(xì)胞系的GI50、TGI和LC50匯總畫出均數(shù)圖，從此圖可以大致看出該化合物對不同的腫瘤細(xì)胞株的抑制能力。然后用計算機進行計算、模擬、比較，評價受試化合物的特征是否與某一類已知化療藥物類似，從而推測可能存在的抗癌機制。據(jù)統(tǒng)計，NCI到目前為止已篩選了近460000種化合物。用NCI體外化療藥物篩選系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)也可用于指導(dǎo)將來對主要化合物的改造，使化合物的藥理及毒理性質(zhì)更為理想。1.3以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的化療藥物篩選方法近年來，對腫瘤的分子生物學(xué)研究取得了很大的進展，這給化療藥物的發(fā)展提供了一些新的目標(biāo)?，F(xiàn)在已有許多采用X射線衍射、蛋白結(jié)晶、基因配對等方法來推斷及設(shè)計抗癌藥物。這些方法往往開拓了一些全新的途徑，但其缺點是這些化合物不一定對腫瘤細(xì)胞有選擇性。另外，這些化合物是否能進入腫瘤細(xì)胞也是一大問題。因此，任何采用非細(xì)胞系統(tǒng)篩選的化合物都必須經(jīng)過細(xì)胞系統(tǒng)以及合適的動物模型的檢定才能進入臨床試驗。1.4經(jīng)典的化療藥物篩選模型1985年NCI建立體外細(xì)胞篩選系統(tǒng)。在此之前，NCI抗癌藥物的篩選方法主要采用體內(nèi)腫瘤模型來進行。將白血病細(xì)胞株L1210及P388植入免疫缺陷鼠體內(nèi)，待腫瘤長成后再給予不同劑量的篩選化合物，然后觀察所試化合物是否能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，甚至使腫瘤細(xì)胞死亡、消失。然后再作計算分析，得出最小抑制劑量、中位抑制劑量、LC50等指標(biāo)；以這些指標(biāo)作為衡量受試化合物的抗癌作用強度。這一方法的優(yōu)點是得到的藥物可穿過細(xì)胞膜以及某些生理屏障，缺點是所得到的藥物僅對快速分裂的腫瘤(如白血病、淋巴瘤)療效較好，而對實體瘤的治療遠不盡人意。針對這一問題，NCI在1985年對抗癌藥物的篩選過程作了如下重大改變：①利用以腫瘤種類為指導(dǎo)的體外細(xì)胞篩選法取代體內(nèi)篩選法；②利用實體瘤細(xì)胞株取代白血病細(xì)胞株；③用相對小量的原始材料用于初篩；④重新強調(diào)利用生物實驗指導(dǎo)天然物中具抗癌活性成分的篩選。體內(nèi)實驗的免疫缺陷鼠腫瘤模型現(xiàn)已不常用于藥物的初篩，而常規(guī)用于對初篩所得的先導(dǎo)藥物作進一步測試以觀察評估