醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)新技術(shù)應(yīng)用

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)新技術(shù)應(yīng)用代謝組學(xué)及研究技術(shù)microRNA的研究及應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)（Co-Immunoprecipitation）4.胞內(nèi)RNA分子可視技術(shù)第一節(jié)代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展什么是代謝組學(xué)？代謝組學(xué)研究方法代謝組學(xué)分析技術(shù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS）核磁共振技術(shù)（NMR）代謝組學(xué)研究什么？？生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）代謝產(chǎn)物發(fā)生變化（種類，隨時(shí)間變化）特定基因突變環(huán)境變化生物體系代謝組學(xué)研究對象體內(nèi)各種物質(zhì)代謝過程互相聯(lián)系形成一個(gè)整體

糖類

脂類蛋白質(zhì)水

無機(jī)鹽維生素各種物質(zhì)代謝之間互有聯(lián)系，相互依存。

消化吸收中間代謝廢物排泄機(jī)體物質(zhì)代謝不斷受到精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)體有精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)代謝的強(qiáng)度、方向和速度內(nèi)外環(huán)境的變化對機(jī)體代謝造成影響適應(yīng)環(huán)境的變化精細(xì)的調(diào)節(jié)控制

代謝組(metabolome)是指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合,包含一系列不同化學(xué)型的分子,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質(zhì)的催化產(chǎn)物等。代謝組學(xué)(metabonomics／metabolomics)來源于代謝組一詞,是研究一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有小分子代謝組分集合的科學(xué)。代謝組學(xué)研究的目的是定量分析一個(gè)生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物的含量。

代謝組學(xué)分析可以指示細(xì)胞、組織或器官的生化狀態(tài),協(xié)助闡釋新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代謝網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)聯(lián)性,幫助人們更系統(tǒng)地認(rèn)識生物體。進(jìn)行代謝組學(xué)研究涉及生命科學(xué)、分析科學(xué)以及化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)三大方面的專業(yè)知識。代謝物化學(xué)分析技術(shù)及數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展極大促進(jìn)了諸多生物、醫(yī)學(xué)問題的研究,這些知識的綜合運(yùn)用使得代謝組研究在疾病診斷、藥理研究以及臨床前毒理等研究中發(fā)揮了極為重要的作用。普遍定義代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。研究對象：相對分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子。代謝物小分子類別：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂類、金屬離子。特點(diǎn)1.關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物。2.對生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究3.內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響。4.內(nèi)源性化合物的特點(diǎn)用來表征疾病和藥物篩選。代謝組學(xué)的發(fā)展198219831984198919992000200120022007VanDeGreef:

publicationofMSforurineprofilingSadler,BuckinghamandNicholson:

Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:

PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAnttiExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublications研究方法研究步驟：生物組織，體液經(jīng)滅活預(yù)處理多個(gè)方法聯(lián)用ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics應(yīng)用藥物研發(fā)疾病研究植物代謝組學(xué)微生物代謝組學(xué)中藥現(xiàn)代化連接圖數(shù)據(jù)庫ConnectionsMapDB京都基因與基因組百科全書KEGG()生物化學(xué)途徑ExPASy互聯(lián)網(wǎng)主要代謝途徑mainmetabolicpathwaysonInternert,MMPDuke博士植物化學(xué)和民族植物學(xué)數(shù)據(jù)庫Arizona大學(xué)天然數(shù)據(jù)庫Wiley_handbookofgc-ms新藥及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜庫“腫瘤”代謝組數(shù)據(jù)庫Pubmed化合物數(shù)據(jù)庫NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫一些有用的數(shù)據(jù)庫：代謝組學(xué)分析技術(shù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS)核磁共振技術(shù)（NMR）分析技術(shù)1.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）工作原理：氣相色譜儀接口質(zhì)譜儀常壓高真空離子源質(zhì)量分析器檢測器質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)及工作流程

幾種新的GC-MS技術(shù)全二維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)（GC×GC-TOFMS）氣化室檢測器色譜柱1色譜柱2調(diào)制器研究實(shí)例用LecoChromaTOFsoftware得到的質(zhì)荷比為73（m/z）的離子碎片典型GC×GC-TOFMS二維血漿色譜圖（AnalyticaChimicaActa，2009，633，257-262）大連化物所許國旺教授分析確定5種糖尿病病源標(biāo)記物：葡萄糖、2-羥基異丁酸、亞麻油酸、軟脂酸、磷酸。脂肪酸代謝紊亂GC-MS適用于揮發(fā)性的代謝物。對于非揮發(fā)性代謝物的分析需要經(jīng)過化學(xué)衍生。多用于環(huán)境分析、大氣有毒氣體分析、某些疾病診斷等。2.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）

LC工作原理：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的新技術(shù)4000QTrapLC/MS/MS高效液相色譜系統(tǒng)配合液相質(zhì)譜系統(tǒng)。健康和慢性乙肝病人的血清樣本。使用PLS-DA處理代謝數(shù)據(jù)正常組和慢性乙肝組對照（JournalofProteomeResearch,2006,5,554-561）

新型液相色譜技術(shù)UPLC新型超高液相色譜儀HPLC色譜柱填料顆粒：3、5μmUPLC色譜柱填料顆粒：1.7μm分離能力得到空前提高

比較（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代謝物TOP質(zhì)譜全掃描（RapidCommunMassSpectrom,2005,19,843）UPLC在代謝組學(xué)中的研究優(yōu)勢UPLC相對于傳統(tǒng)的HPLC有更好的分離效率、峰容量、及靈敏度，提供更適合與質(zhì)譜聯(lián)用的接口，有助于檢出更多的代謝物。提高方法通量、靈敏度，改善與質(zhì)譜聯(lián)用的定性定量結(jié)果。UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用為代謝組學(xué)研究提供更加高效、靈敏的研究平臺(tái)。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS）代謝組學(xué)研究的生物樣品中包含多種離子性代謝物（糖酵解代謝產(chǎn)物、三羧酸循環(huán)代謝物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、輔酶等代謝物。）毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實(shí)現(xiàn)分離。適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分離分析。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（蘭州理工大學(xué)）

型號：P/ACEMDQ-DecaXPplus

廠家：美國BeckanCoulter-Finnigan

（NMR）基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級躍遷譜學(xué)，主要用于反映化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。1H-NMR：在排除雜質(zhì)及水峰的干擾下，1H-NMR的譜峰與樣品中的化合物的氫原子是一一對應(yīng)的。所測的樣品中的每一個(gè)氫在譜圖中都有唯一的譜峰與之相對應(yīng)。圖譜中信號的強(qiáng)弱則反映出樣品中各組分相對含量的關(guān)系，適用于研究代謝產(chǎn)物。核磁共振電子云：基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級躍遷譜學(xué)。主要用于反應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。

hr-MASofbiologicaltissue相同強(qiáng)度LipidCH2-COLipidCH2-C=CLipidCH2-CH2-COLipidCH2LipidCH3CitrateLactateAlanine放大＊１０人前列腺組織（prostatetissu）良性vs.惡性癌癥組織給出更多的脂類物含量（lipid）?。?！代謝組學(xué)研究一般包括四個(gè)步驟：第一步，給予生物體一定的刺激。第二步，代謝組數(shù)據(jù)的采集。用核磁共振、質(zhì)譜、色譜等分析手段測定其中代謝物的種類、含量和狀態(tài)以及其變化。第三步，建立表征代謝特征的時(shí)空模型。在代謝組學(xué)中最常用的建模方法是主成分分析(PrincipleComponentsAnalysis,PCA)。第四步，建立代謝物時(shí)空變化與生物體特性的關(guān)系，達(dá)到從不同層次和水平上闡述生物體對相應(yīng)刺激的響應(yīng)的目的。microRNA的研究與應(yīng)用3510.1.1概述10.1.2.microRNA的分子生物學(xué)研究方法10.1.3microRNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)10.1.4microRNA與疾病內(nèi)容結(jié)構(gòu)36概述miRNA是由21~25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。?什么是miRNA？37概述·

MicroRNA的發(fā)現(xiàn)lin-4:Lee等人于1993年在線蟲中通過胚胎發(fā)育時(shí)間控制缺陷性遺傳篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA。

lin-4在L1,L2階段大量表達(dá)，如缺失，則導(dǎo)致幼蟲發(fā)育停頓。

L1

L2

L3

L4L1~L4，線蟲發(fā)育的四個(gè)不同階段38let-7:Rinhart等人于2000年在線蟲發(fā)現(xiàn)第二個(gè)miRNA，let-7。

let-7在L3,L4階段大量表達(dá)，控制幼蟲的L4階段向成蟲階段發(fā)育轉(zhuǎn)換。L1~L4，線蟲發(fā)育的四個(gè)不同階段

L1

L2

L3

L4概述·

MicroRNA的發(fā)現(xiàn)39MicroRNA的起源與生物合成過程1.miRNA基因被轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA(RNA聚合酶Ⅱ)；2.pri-miRNA被剪切成具有70-100個(gè)核苷酸的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)；3.pre-miRNA從核內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)(Exportin-5,Ran-GTP)；4.pre-miRNA被剪切成21-25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA雙體(Dicer,TRBP,PACT)；5.雙鏈RNA雙體中成熟miRNA鏈會(huì)選擇性整合入RISC,并與mRNA互補(bǔ)配對。40MicroRNA的起源與生物合成過程microRNAgenePolⅡ

①②

Drosha/DGCR8Pri-miRNAPre-miRNACytoplasm③④Dicer/TRBP/PACTduplexintermediate⑤

RISCmaturemiRNAmiRNAbiogenesis

NucleusExportin-5/Ran-GTP41miRNA與siRNA的性質(zhì)比較miRNAsiRNA相同點(diǎn)長度及特征分子量約22nt，5'端是磷酸基，3'端是羥基合成的底物均由雙鏈RNA或RNA前體加工而來Dicer酶依賴Dicer酶并具有Dicer加工產(chǎn)物的特征Argonaute家族蛋白均需Argonaute家族蛋白參與RISC均為RISC組分，在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有相似之處作用方式均可抑制靶基因翻譯或?qū)е耺RNA降解進(jìn)化關(guān)系兩種假設(shè)：siRNA是miRNA的補(bǔ)充；miRNA在進(jìn)化過程中替代了siRNA

引自方福德,microRNA的研究方法與應(yīng)用,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,200842miRNAsiRNA不同點(diǎn)機(jī)制性質(zhì)是生物體正常的調(diào)控機(jī)制往往是外源引起直接來源發(fā)夾狀pre-miRNA長鏈dsRNA分子結(jié)構(gòu)單鏈RNA雙鏈RNA，3‘端有2個(gè)非配對堿基對靶基因mRNA特異性較低，一個(gè)突變不影響miRNA的抑制作用較高，一個(gè)突變?nèi)菀滓餜NAi沉默效應(yīng)的改變作用方式miRNA途徑RNAi互補(bǔ)性不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象一般要求完全互補(bǔ)生物學(xué)功能對機(jī)體的生長發(fā)育有重要作用抗病毒的防御機(jī)制；沉默過表達(dá)的mRNA；保護(hù)基因組免受轉(zhuǎn)座子侵入重要特性高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性高度特異性續(xù)表143miRNAsiRNA不同點(diǎn)作用機(jī)制通過與miRNP核蛋白體復(fù)合物結(jié)合，識別靶基因mRNA，并與之部分互補(bǔ)，從而抑制其翻譯。在動(dòng)物中，成熟的miRNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物miRNP結(jié)合，引導(dǎo)這種復(fù)合物通過部分互補(bǔ)結(jié)合mRNA3‘-UTR，從而抑制其翻譯。miRNA也可切割完全互補(bǔ)的mRNA滲入RISC中，引導(dǎo)復(fù)合物與mRNA完全互補(bǔ)，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNA，通過反義siRNA鏈識別目的mRNA，通過內(nèi)切酶活性切割目的片段，再通過細(xì)胞外切酶進(jìn)一步降解目的片段。siRNA也可以抑制具有短片段互補(bǔ)性的mRNA翻譯加工過程不對稱加工，僅剪切pre-miRNA一個(gè)側(cè)臂，其他部分降解對稱地剪切來源于雙鏈RNA前體的兩個(gè)側(cè)臂對RNA的影響與mRNA的穩(wěn)定性無關(guān)影響mRNA的穩(wěn)定性作用位置作用于靶基因3‘-UTR作用于mRNA的任何部位生物學(xué)意義主要在發(fā)育過程中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)不參與生物發(fā)育，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性與抵御病毒感染續(xù)表244MicroRNA的鑒定

正向遺傳學(xué)的突變篩查方法（最初幾個(gè)miRNA分子的發(fā)現(xiàn)；效率不高）；cDNA克隆技術(shù)（有優(yōu)勢也有不足）；生物信息學(xué)預(yù)測方法（是實(shí)驗(yàn)預(yù)測方法有益和必要的補(bǔ)充；目前兩個(gè)最主要的miRNA基因預(yù)測工具：MiRscan和miRseeker）

當(dāng)然計(jì)算機(jī)預(yù)測的miRNA必須經(jīng)過RT-PCR或Northern試驗(yàn)分析才能鑒定

45MicroRNA的特征廣泛存在于真核生物中,是一類內(nèi)源性表達(dá)的非編碼短序列RNA,本身不具有開放閱讀框(ORF)；成熟的miRNA長度通常為21～25nt；miRNA在進(jìn)化上具有高度保守性；miRNA表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性，同時(shí)具有時(shí)序性

如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)

46MicroRNA的功能miRNA通過基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程參與了生命體的發(fā)生、生長、發(fā)育、分化和死亡的各個(gè)過程。如線蟲幼蟲發(fā)育階段的轉(zhuǎn)換，哺乳動(dòng)物的造血分化，脂類代謝，激素分泌，癌癥，糖尿病，白血病以及病毒感染等。47miRNA靶基因功能作用lin-4lin-14,lin-28線蟲早期時(shí)序發(fā)育let-7lin-41,RAS線蟲晚期時(shí)序發(fā)育lsy-6Cog-1線蟲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育mir-273Die-1線蟲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育bantamHid果蠅細(xì)胞凋亡mir-14未知果蠅細(xì)胞凋亡及脂類代謝mir-430未知斑馬魚神經(jīng)發(fā)育mir-181未知小鼠B淋巴細(xì)胞分化mir-375Mtpn小鼠胰島素分泌mir-15/16BCL-2人B淋巴細(xì)胞慢性白血病mir-155未知人彌散性大B淋巴瘤mir-17-92E2F1人B細(xì)胞淋巴瘤和肺癌部分已知功能的miRNA引自方福德,microRNA的研究方法與應(yīng)用,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,200848miRNA靶基因功能作用mir-223NF1A人粒系分化mir-23bHes1小鼠神經(jīng)發(fā)育mir-206Connexin43雞骨骼肌發(fā)育mir-125a/bERBB2,ERBB3調(diào)節(jié)原癌基因的表達(dá)mir-1未知影響人脂肪基質(zhì)細(xì)胞成肌潛能mir-133a未知人肌細(xì)胞發(fā)育mir-9aSens調(diào)節(jié)果蠅感官發(fā)育mir-122未知人肝癌發(fā)生續(xù)表49MicroRNA的調(diào)控機(jī)制mRNA剪切

miRNA與靶mRNA幾乎完全互補(bǔ)；切割位點(diǎn)在從5‘端起與miRNA配對的第10位和11位核苷酸之間；由RISC中的內(nèi)切酶催化完成；可催化多個(gè)mRNA分子的降解翻譯抑制

miRNA與靶mRNA互補(bǔ)程度較低；翻譯抑制可能發(fā)生在翻譯起始后的某一階段；翻譯順利進(jìn)行但翻譯產(chǎn)物可能被特異性降解每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)50MicroRNA表達(dá)的研究方法

miRNA基因芯片技術(shù)，高通量檢測miRNA表達(dá)情況的最佳選擇；PAGE/Northernblotting雜交法，可用于miRNA表達(dá)水平的定量檢測，還能與RNAmarker結(jié)合使用檢測miRNA分子的大小，用來排除其他小分子RNA的污染；原位雜交，可直觀顯示生物體miRNA的時(shí)間和組織特異性表達(dá)譜；miRNA實(shí)時(shí)定量PCR，可高度靈敏地檢測出低豐度表達(dá)地靶分子，適用于高通量篩選。51miRNA功能研究的主要實(shí)驗(yàn)策略引自JKrtzfeldt,MatthewNPoyandStoffel.StrategiestodeterminethebiologicalfunctionofmiRNAS.NatureGenetics,2006,38(suppl):S14-S19DicermutantsGlobalmiRNAKnockoutTissue/cellsmiRNAidentificationPhenotypeGeneexpressionprofilingmiRNAoverexpressionmiRNASilencingMicroarraygeneexpressionTargetvalidationRescuePhenotypePhenotypePhenotypeDiseasemodelmiRNAprofilingGeneexpressionprofilingNormalizemiRNAprooverexpression/silencingBioinformatics52MicroRNA功能研究方法

miRNA體外或體內(nèi)水平的過表達(dá)研究

構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體體外合成miRNA前體分子miRNA表達(dá)抑制研究

基因水平抑制miRNA表達(dá)使用反義核酸分子抑制miRNA表達(dá)53miRNA基因克隆（一）基本原理：miRNA克隆是依賴于其本身的特殊結(jié)構(gòu)，5′端的磷酸基團(tuán)和3′端的羥基基團(tuán)，以T4RNA連接酶在分子末端加上連接子，然后利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得目的片段，克隆到合適的載體，最后測序驗(yàn)證。（二）應(yīng)用：microRNA基因克隆主要用于尋找新microRNA基因，同時(shí)還可獲得精確的表達(dá)信息。55MichaelMZ,2006TotalRNA5'POH3'PAGEsizeseparation5'HOOH3'Phosphatase5'HOT4RNAligase5'PP3'3'adapterP3'5'PP3'T4polynucleotidekinase-OH3'P3'T4RNAligaseP3'BanⅠBanⅠ5'adapterRT-PCRBanⅠBanⅠdigest,religate,ligateintoplasmidvectorandsequenceinsertsmiRNA基因克隆策略56miRNA基因克隆的基本步驟（一）總RNA的提取關(guān)鍵：盡量不使小RNA丟失（二）小分子RNA分離純化及富集變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）方法是用于小分子RNA分離純化的理想方法。（三）小分子RNA片段修飾小分子RNA的修飾包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端連接上連接子等57miRNA基因克隆的基本步驟（四）克隆及測序鑒定含3‘與5’端接頭的小分子RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后連接至合適的載體，轉(zhuǎn)化克隆，最后用相關(guān)方法鑒定陽性克隆。（五）PAGE/Northernblotting驗(yàn)證

PAGE/Northernblotting方法是確認(rèn)microRNA最有效和常用的方法。58PAGE/Northernblotting（一）基本原理：PAGE/Northernblotting與常規(guī)核酸雜交技術(shù)原理相同，都是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，設(shè)計(jì)特異探針，與膜雜交，經(jīng)放射自顯影后分析雜交信號。唯一的差別在于選擇對小分子RNA分離效率更高的PAGE代替瓊脂糖作為分離膠。（二）應(yīng)用：PAGE/Northernblotting方法能提供準(zhǔn)確的雜交信息以及有效檢測低豐度的RNA分子，在驗(yàn)證micorRNA基因芯片結(jié)果及降低假陽性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技術(shù)。59PAGE/Northernblotting基本操作步驟（一）總RNA的提取關(guān)鍵：盡量不使小RNA丟失（二）樣品處理取適量提取的RNA樣品于上樣緩沖液及去離子甲酰胺中混勻，55℃孵育30min，冰浴后準(zhǔn)備PAGE分離。（三）PAGE分離、轉(zhuǎn)膜及固定60PAGE/Northernblotting基本操作步驟（四）寡核苷酸探針的制備探針標(biāo)記可選擇放射性核素或非放射性熒光，其中放射性核素敏感度高，可檢測較低豐度的microRNA分子（五）雜交、洗膜、壓片及顯影（六）如果選用放射性標(biāo)記的探針，在分析結(jié)果后要去除Northern印記膜上的放射性，避免放射性污染。61MicroRNA基因芯片技術(shù)

基本原理：MicroRNA基因芯片的基本原理與以往傳統(tǒng)基因芯片的使用原理基本相同，即經(jīng)過標(biāo)記的待測microRNA與芯片上特定位置的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則雜交，再經(jīng)特定儀器掃描，以計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件對熒光信號進(jìn)行檢測，并轉(zhuǎn)化為可讀的數(shù)字信息，最后經(jīng)大量數(shù)據(jù)分析篩選出有顯著表達(dá)差異的microRNA。62MicroRNA基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用：

（1）尋找和發(fā)現(xiàn)新microRNA基因；（2）miRNA相關(guān)疾病的診斷和治療，如腫瘤、白血病、糖尿病等；（3）藥物篩選和藥物開發(fā)等；

63MicroRNA基因芯片技術(shù)操作流程示意圖LiW,RuanKC.200964MicroRNA基因芯片技術(shù)操作流程（一）MicroRNA基因芯片的設(shè)計(jì)與制作可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行設(shè)計(jì)芯片，需要考慮探針的種類、點(diǎn)陣數(shù)目及片基種類等；也可向市面上購買芯片（二）RNA提取與純化（三）RNA樣品的標(biāo)記

MicroRNA芯片表達(dá)譜分析的一個(gè)前提條件是檢測到所有的microRNA，并且結(jié)果具有可重復(fù)性。因此，選擇合適的microRNA標(biāo)記系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)芯片表達(dá)譜檢測精確性的一個(gè)保證。65MicroRNA基因芯片技術(shù)操作流程（四）芯片雜交及后處理由于microRNA分子量小，因此，雜交反應(yīng)條件及雜交后洗脫條件需謹(jǐn)慎選擇。（五）圖像采集和數(shù)據(jù)分析

MicroRNA基因芯片圖像的采集和分析是microRNA芯片技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，芯片圖象獲取的準(zhǔn)確性和分析的可靠性直接影響芯片的應(yīng)用。（六）驗(yàn)證由于microRNA基因芯片結(jié)果存在假陽性的可能性，需要用PAGE/Northernblotting、定量PCR等方法驗(yàn)證。66MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR基本原理：利用能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)，顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)累積，得到S型的擴(kuò)增曲線；假設(shè)該曲線的前期PCR符合指數(shù)性擴(kuò)增，于是在單純指數(shù)方程的基礎(chǔ)上，通過比較產(chǎn)物積累的速度來間接比較初始模板的分子數(shù)。最初，實(shí)時(shí)定量PCR被用于定量檢測小RNA分子的前體表達(dá)；現(xiàn)在，經(jīng)過方法改進(jìn)可用于檢測成熟小RNA分子的表達(dá)。67MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR主要應(yīng)用：

（1）microRNA的定量檢測，可精確檢測出細(xì)胞或組織樣品中特定微量的microRNA表達(dá)水平；（2）由于該方法可以同時(shí)檢測microRNA及其前體，因此，可以根據(jù)兩者在不同發(fā)育階段的表達(dá)差異情況來深入了解microRNA的起源和發(fā)生；（3）應(yīng)用于臨床診斷和治療等。68TaqMan?MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR示意圖5′3′microRNARTprimercDNAForwardprimerReverseprimerQFReal-timePCRReversetranscriptionTaqManprobeChenCF,RidzonDA,BroomerAJ,etal.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem–loopRT–PCR.NucleicAcidsRes.2005;33(20):e17969MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR操作步驟（一）總RNA提取、小分子RNA的分離純化及富集（二）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

MicroRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與普通的針對mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程基本相似，但也有其特異之處，如它的逆轉(zhuǎn)錄酶的特異性等。（三）實(shí)時(shí)定量PCR

針對microRNA的實(shí)時(shí)定量PCR的熱學(xué)反應(yīng)條件要謹(jǐn)慎選擇。70MicroRNA與疾病MicroRNA與人類疾病包括腫瘤、糖尿病、炎癥、心臟疾病、病毒感染等的發(fā)生密切相關(guān)。

MicroRNA造成疾病發(fā)生的可能原因有：突變、基因表達(dá)失活、低效轉(zhuǎn)錄等原因造成的microRNA表達(dá)下調(diào)；啟動(dòng)子區(qū)域基因擴(kuò)增或突變等原因造成的microRNA表達(dá)上調(diào)等。71microRNA引發(fā)癌癥的可能原因：（1）microRNA與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，而腫瘤則是由細(xì)胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發(fā)的；（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發(fā)生斷裂、移位、缺失等變異的區(qū)域；（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中普遍存在著對microRNA的表達(dá)失控

72充當(dāng)抑癌基因作用的miRNA:miR-15a和miR-16-1:這兩個(gè)miRNAs的缺失或下調(diào)，促進(jìn)了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的發(fā)生。mir-143和mir-145:在結(jié)腸癌中明顯下調(diào)充當(dāng)癌基因作用的miRNA:

miR-21:在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加

miR-155:在Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤等腫瘤中表達(dá)上升腫瘤類別表達(dá)變化趨勢microRNAID經(jīng)驗(yàn)證的靶基因

肺癌表達(dá)上調(diào)miR-26a1miR-21TPM1miR-24-1(miR-189)miR-17-92miR-30amiR-143ERK5miR-145miR-188miR-331

表達(dá)下調(diào)miR-200bLet-7HMGA2,RAS目前肺癌中已經(jīng)表達(dá)分析及初步功能研究的部分microRNA74MicroRNA與糖尿病MicroRNA引發(fā)糖尿病的可能原因：（1）MicroRNA參與胰島素的合成分泌調(diào)節(jié)；（2）MicroRNA對血糖代謝起著直接或間接的調(diào)控作用；（3）MicroRNA與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)；75已知功能的部分miRNA與糖尿病的關(guān)系A(chǔ)mitK.Pandey,etal.,200976miRNA的綜合信息網(wǎng)站：http://77免疫共沉淀技術(shù)ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsShenetal,GenesandDevelopment.2010ShenetalMBC2009ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsShenetal2010ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics參考文獻(xiàn)1.ZhifaShen,AnikSt-DenisandPascalChartrand.Cotranscriptionalrecruitment