生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-電泳市公開(kāi)課獲獎(jiǎng)?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

生物化學(xué)試驗(yàn)

Biochemical

Experiment1/96人員組成主講教師：呂曉玲（教授）劉常金（副教授博士）曹東旭（副教授博士）王德培（副教授博士）白小佳（講師博士）李昌模（副教授博士）張燕（副教授博士）方國(guó)臻（副教授博士）試驗(yàn)輔助：高輝（試驗(yàn)師）姚秀玲（試驗(yàn)師）2/96試驗(yàn)內(nèi)容安排共36課時(shí)1、生物化學(xué)試驗(yàn)規(guī)則及慣用儀器使用入門(mén)（2課時(shí)）2、離子交換柱層析法分離氨基酸（5課時(shí)）3、3，5－二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖（5課時(shí)）4、多酚氧化酶制備、性質(zhì)及其影響原因（6課時(shí)）5、堿性蛋白酶活力測(cè)定－福林酚試劑法（4課時(shí)）6、SDS－PAGE分離蛋白質(zhì)（6課時(shí)）7、植物中核酸分離與判定(5課時(shí))8、Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量（3課時(shí)）3/961試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖等主要物質(zhì)分離、純化和測(cè)定技術(shù)原理及方法；掌握生物化學(xué)基本知識(shí)、基本理論及基本試驗(yàn)技能；培養(yǎng)分析和處理問(wèn)題能力以及嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致科學(xué)作風(fēng)、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)。

緒論4/962經(jīng)過(guò)生物化學(xué)試驗(yàn)應(yīng)該做到學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)基本思緒，掌握各個(gè)試驗(yàn)基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自己試驗(yàn)，合理地安排試驗(yàn)步驟和時(shí)間。訓(xùn)練試驗(yàn)動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種生物化學(xué)試驗(yàn)儀器。學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)技能，提升試驗(yàn)匯報(bào)寫(xiě)作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行全部試驗(yàn)。掌握生物化學(xué)各種基本試驗(yàn)方法和試驗(yàn)技術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今后參加科研工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。5/963.1試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)前寫(xiě)好試驗(yàn)預(yù)習(xí)匯報(bào)(鋼筆和園珠筆)。試驗(yàn)中應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)(專(zhuān)用紙，事先在統(tǒng)計(jì)紙上設(shè)計(jì)好各種統(tǒng)計(jì)格式和表格）所觀察到現(xiàn)象和測(cè)量數(shù)據(jù)。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個(gè)結(jié)果都要盡可能重復(fù)觀察二次以上，即使觀察數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實(shí)統(tǒng)計(jì)，不得涂改。試驗(yàn)中要詳細(xì)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)條件，如使用儀器型號(hào)、編號(hào)、生產(chǎn)廠等；生物材料起源、試劑規(guī)格、試劑濃度等。

3試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與試驗(yàn)匯報(bào)6/963試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與試驗(yàn)匯報(bào)3.2試驗(yàn)匯報(bào)試驗(yàn)匯報(bào)格式應(yīng)為：⑴試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)；⑵試驗(yàn)原理；⑶儀器、材料和試劑；⑷試驗(yàn)步驟；⑸結(jié)果討論（含數(shù)理?yè)?jù)處）；⑹注意事項(xiàng);(7)思索題注意：試驗(yàn)結(jié)果討論要充分，盡可能多查閱一些相關(guān)文件和教科書(shū)，充分利用己學(xué)過(guò)知識(shí)和生物化學(xué)原理，進(jìn)行深入探討，勇于提出自己獨(dú)到分析和看法，并歡迎對(duì)試驗(yàn)提出改進(jìn)意見(jiàn)。7/964試驗(yàn)成績(jī)?cè)u(píng)分方法試驗(yàn)預(yù)習(xí)情況（10%）試驗(yàn)操作情況（20%）試驗(yàn)匯報(bào)情況（30%）試驗(yàn)考試成績(jī)（40%）8/96生物化學(xué)試驗(yàn)技術(shù)理論層析技術(shù)9/9619，俄國(guó)科學(xué)家M.C.Jber首創(chuàng)了一個(gè)從綠葉中分離各種不一樣顏色色素成份方法，命名為色譜法(Chromatography)，因?yàn)榉g和習(xí)慣原因．又常稱(chēng)為層析法。80多年來(lái)，層析法不停發(fā)展，形式各種多樣。50年代開(kāi)始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親和層析、吸附層析等。幾乎每一個(gè)層析法都已發(fā)展成為一門(mén)獨(dú)立生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。一、層析技術(shù)10/96一、層析技術(shù)1、層析技術(shù)原理2、層析技術(shù)分類(lèi)3、慣用層析技術(shù)原理11/961、層析技術(shù)原理層析原理：是一個(gè)物理分離方法，利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分以不一樣程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過(guò)此相當(dāng)作流動(dòng)相，并使各組分以不一樣速度移動(dòng)，從而到達(dá)分離目標(biāo)?？煞蛛x物質(zhì)：糖類(lèi)、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸。12/962、層析技術(shù)分類(lèi)名稱(chēng)操作方式固定相流動(dòng)相分離依據(jù)分配層析紙層析薄層層析液體液體溶解度離子交換層析離子交換柱層析固體液體帶電性靜電引力吸附層析吸附薄層層析氣體吸附層析固體固體液體氣體吸附力親合層析酶與底物抗原與抗體固體液體配體專(zhuān)一性凝膠層析凝膠過(guò)濾固體液體分子大小13/963、慣用層析原理（1）分配層析——紙層析原理：溶質(zhì)在互不相溶兩相中溶解度不一樣，在終點(diǎn)時(shí)到達(dá)一個(gè)平衡，其比值為一個(gè)常數(shù)，即分配系數(shù)（α）。固定相內(nèi)溶質(zhì)濃度流動(dòng)相內(nèi)溶質(zhì)濃度固定相：濾紙上吸附水流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（正丁醇）α=14/9612864643264321648481683248328420404020421230403012215/96紙層析紙層析是最簡(jiǎn)單液一液相分配層析。濾紙是紙層析支持物。當(dāng)支持物被水飽和時(shí)，大部分水分子被濾紙纖維素牢牢吸附，所以，紙及其飽和水為層析固定相，與固定相不相混溶有機(jī)溶劑為層析流動(dòng)相。對(duì)一些特定化合物，在特定展層系統(tǒng)，一定溫度條件下，Rf是個(gè)常數(shù)。16/96（2）離子交換層析原理：將能與周?chē)橘|(zhì)進(jìn)行離子交換不穩(wěn)定離子固定于惰性基質(zhì)上，從而分離介質(zhì)中組分。慣用惰性基質(zhì)：人工合成樹(shù)脂（單體：苯乙烯、交聯(lián)劑：二乙烯苯）陽(yáng)離子交換劑：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基陰離子交換劑：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交換離子：陽(yáng)離子：Na+、H+

陰離子：Cl-、OH-17/96示意圖（交換樹(shù)脂表面）18/96示意圖（離子交換過(guò)程）電離基團(tuán)（磺酸根）可交換離子（鈉離子）交換離子不交換離子19/96示意圖水分子B物質(zhì)A物質(zhì)20/96（3）吸附層析原理：當(dāng)氣體或液體中某組分分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面時(shí)，分子會(huì)貼在固體表面上并停留一定時(shí)間然后才離開(kāi)，此為吸附現(xiàn)象。吸附現(xiàn)象形成原因：吸附作用可能由幾個(gè)作用力形成，包含被吸附物與吸附劑之間相反電荷基團(tuán)與基團(tuán)之間靜電引力(形成離子鍵)、氫鍵及范德華引力等。在不一樣條件下，占主要地位作用力可能不一樣，也可能幾個(gè)力同時(shí)起作用吸附劑：氧化鋁、活性炭、硅膠；纖維素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。21/96吸附層析示意圖吸附劑易吸附分子不易吸附分子22/96（4）親和層析原理：利用分子間含有專(zhuān)一親和力而設(shè)計(jì)層析技術(shù)。專(zhuān)一親和力分子對(duì)：酶與底物、特異性抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體載體：使親和物固相化水不溶性化合物。如：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。23/9624/96（5）凝膠過(guò)濾原理：被分離物質(zhì)因分子大小不一樣，在凝膠中向下移動(dòng)速度不一樣。物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運(yùn)動(dòng)方式：垂直向下移動(dòng)和無(wú)定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)直徑大無(wú)法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分布于顆粒間隙中向下移動(dòng)快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)，所以向下移動(dòng)慢。凝膠物質(zhì)：馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠。25/9626/96電泳技術(shù)一.電泳概念二.電泳技術(shù)分類(lèi)三.電泳技術(shù)基本原理四.幾個(gè)常見(jiàn)電泳方法比較五.聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理27/96一.電泳概念帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移動(dòng)現(xiàn)象。28/96二.電泳技術(shù)分類(lèi)29/96三.電泳技術(shù)基本原理1.基本原理

不一樣帶電顆粒在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀相關(guān)。pH>pI分子帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng);

pH<pI分子帶正電荷,在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng);

泳動(dòng)度u=v=d/t=dleV/lVt30/962.影響電泳速度原因(1)電場(chǎng)強(qiáng)度泳動(dòng)速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比常壓電泳(100—500V).2—10V/cm，幾小時(shí)或幾天；蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì);高壓電泳(500—1000V).20—200V/cm，幾分鐘；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì);（2）溶液pH值pH距待分離物質(zhì)pI越遠(yuǎn)，泳動(dòng)速度越大；（3）溶液離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越小,電動(dòng)勢(shì)越大,泳動(dòng)速度越快。（4）電滲現(xiàn)象：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物相對(duì)移動(dòng)。31/96四.幾個(gè)常見(jiàn)電泳比較類(lèi)型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)紙電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)整凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無(wú)電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離32/96五.聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理1.原理

含有電泳和分子篩雙重作用2.聚丙烯酰胺凝膠聚合單體：丙稀酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)劑(Bis)

催化劑聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH

-CH2-NH-C-CH=CH233/96五.聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理2.聚丙烯酰胺凝膠聚合催化劑（1）過(guò)硫酸銨-TEMED系統(tǒng)堿性條件下催化作用溫度與聚合快慢成正比（2）核黃素-TEMED系統(tǒng)光激發(fā)催化反應(yīng)用量少，對(duì)分析樣品無(wú)影響聚合時(shí)間可自由控制34/96五.聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理3.聚丙烯酰胺凝膠孔徑凝膠越濃T，凝膠孔徑↓，所受阻力，機(jī)械強(qiáng)度

丙稀酰胺濃度分離物質(zhì)分子量4％大于100萬(wàn)7－7.5％1－100萬(wàn)15－30％小于1萬(wàn)膠孔徑為蛋白質(zhì)分子平均大小二分之一時(shí)效果好凝膠強(qiáng)度選擇先用7.5%標(biāo)準(zhǔn)凝膠或4%--10%凝膠梯度測(cè)試35/96五.聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳原理4.緩沖系統(tǒng)選擇pH、離子種類(lèi)和離子強(qiáng)度

酸性蛋白質(zhì)高pH堿性蛋白質(zhì)低pH連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)

電泳槽中緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同電泳槽中緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同，分辨率高36/965.盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（1）盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳四個(gè)不連續(xù)性A.凝膠層不連續(xù)性

濃縮膠T=2.8％C=20%；分離膠T=7％C=2.5%B.緩沖液成份不連續(xù)性：凝膠緩沖液Tris-HCl,含Cl－，電極緩沖液Tris-Gly,Gly－C.pH不連續(xù)性：濃縮膠pH6.7,分離膠pH8.9，電極緩沖液pH8.3D.電位梯度不連續(xù)性37/965.盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（2）盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳三種效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)38/96A.樣品濃縮效應(yīng)緩沖液成份及pH不連續(xù)性濃縮膠pH6.7緩沖液濃縮膠Tris-HCl,電極緩沖液Tris-Gly解離度：

Cl>

蛋>

Glymcl

cl>m蛋

蛋>mGly

Gly凝膠中Cl－為快離子，Gly－為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。緩沖液樣品濃縮膠分離膠39/96緩沖液成份及pH不連續(xù)性造成蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖快離子慢離子蛋白質(zhì)樣品

40/96E：每厘米電壓降E＝I(電流強(qiáng)度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開(kāi)始后，因?yàn)榭祀x子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被深入濃縮。電位梯度不連續(xù)性41/96E：每厘米電壓降E＝I(電流強(qiáng)度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開(kāi)始后，因?yàn)榭祀x子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被深入濃縮。電位梯度不連續(xù)性42/96A.樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包含：緩沖液成份及pH不連續(xù)性電位梯度不連續(xù)性緩沖液濃縮膠樣品分離膠43/96A.樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包含：凝膠層不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠44/96A.樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包含：凝膠層不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠45/96A.樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包含：凝膠層不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠46/96A.樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包含：凝膠層不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠47/96B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后

pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和pH條件下泳動(dòng)。因?yàn)楦鞣N蛋白質(zhì)pI不一樣，所載有效電荷不一樣，所以質(zhì)點(diǎn)有效遷移率不一樣，形成不一樣區(qū)帶。緩沖液濃縮膠分離膠48/96C.分子篩效應(yīng)分離膠孔徑小，各分子因?yàn)榇笮『托螤畈灰粯?，所受阻力不一樣，表現(xiàn)出不一樣泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形泳動(dòng)速度最快。緩沖液濃縮膠分離膠49/96試驗(yàn)一離子交換層析法分離氨基酸一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離氨基酸操作方法和基本原理二、原理氨基酸PI不一樣，在同一pH下所帶電荷數(shù)量和性質(zhì)不一樣，與樹(shù)脂親和力就有差異，所以可依據(jù)親和力從小到大次序依次被洗脫下來(lái)。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：可供交換是陽(yáng)離子；陰離子交換樹(shù)脂：可供交換是陰離子；50/96離子交換層析法分離氨基酸三、操作步驟1、裝柱裝柱是最關(guān)鍵一步。重力沉降法裝柱陸續(xù)不停地添加糊狀物，使其形成膠粒床面上有膠粒連續(xù)均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至適當(dāng)柱床體積為止。柱表面一直要保持著一層溶劑(普通l～3cm柱高)柱任何一部分絕對(duì)不能“流干”。

51/961、裝柱層析柱形狀，普通直徑與高度比為l：15為宜。柱形必須依據(jù)層析介質(zhì)和分離目標(biāo)而定。待分離物質(zhì)性質(zhì)相近，柱越細(xì)長(zhǎng)，則分離效果越好，但流速較慢。在樣品組分并不復(fù)雜情況下，采取“矮胖柱”。52/962、平衡層析柱正式使用前，必須平衡至所需pH和離子強(qiáng)度，普通用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，其洗脫體積相當(dāng)于4-6倍床體積，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。裝好柱必須均勻，無(wú)紋路，不含氣泡，柱頂交換劑沉積表面十分平坦。本試驗(yàn)平衡體積：60－80mL調(diào)整流速：0.5mL/min或8-12滴/min53/963、加樣上樣量：0.3-0.5mL0.5mL緩沖液沖洗加樣處2次注意：加樣同時(shí)開(kāi)始搜集加樣時(shí)且勿攪動(dòng)樹(shù)脂床面54/964、洗脫與搜集盡可能維持衡定柱壓每2分鐘搜集一管，共搜集25管5、氨基酸判定每個(gè)搜集管＋1mL水合茚三酮沸水浴15min比色測(cè)定繪制洗脫曲線55/96試驗(yàn)二SDS分離蛋白質(zhì)一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握SDS工作原理和操作方法二、原理不一樣蛋白質(zhì)含有不一樣分子量，并在一定pH溶液中帶有不一樣電荷。但經(jīng)過(guò)SDS處理后蛋白質(zhì)，分子表面完全被負(fù)電荷所覆蓋，所以在電泳時(shí)，電泳遷移率近取決于蛋白質(zhì)分子量大小而與其所帶電荷性質(zhì)無(wú)關(guān)。分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)56/96SDS分離蛋白質(zhì)三、操作步驟57/9658/961.安裝膜具59/96裝封膠條，注意封膠條平面朝下，不能有裂口60/96蓋上凹玻璃61/96將凹玻璃沖外裝進(jìn)槽里62/96將楔子插進(jìn)，將底部插緊

63/962.配制凝膠溶液膠配制(平行電泳兩塊膠板)膠母液：8.4ml配膠緩沖液：13ml蒸餾水：4ml10%TEMD：0.2ml，混勻10%AP：0.2ml，混勻3.灌膠，加到頂部，往返傾斜去氣泡64/96插入梳子65/96膠凝后用夾子將玻璃夾出66/96用夾子夾緊玻璃將封膠條輕輕撕掉67/96旋轉(zhuǎn)180度，凹玻璃向里68/96將玻璃放進(jìn)槽內(nèi)69/96加緩沖液70/964.樣品制備：

將0.5ml樣品液，0.25ml10%SDS和0.25ml1%巰基乙醇于小試管中，置100℃水浴中煮沸3分鐘后，取出冷卻，然后，加入0.25ml上樣緩沖液（0.05%溴酚蘭+40%蔗糖溶液），混合。取出混合樣品40微升加入樣品槽，每個(gè)樣品重復(fù)兩個(gè)。

71/965.加樣72/966.電泳73/96電泳：

接通電源，電流恒定為80mA，待溴酚蘭指示劑移至離下端0.5cm（約3小時(shí)），切斷電源，拔去插頭，倒出電極緩沖液于大燒杯中（如此緩沖液欲重用時(shí)，應(yīng)把正負(fù)電極液分別貯存）。74/967.剝膠75/968染色：

考馬斯亮藍(lán)染色，詳見(jiàn)教材

9脫色76/96凝膠（脫色之后）結(jié)果分析

1、計(jì)算遷移率（Rm值）：計(jì)算公式見(jiàn)教材。2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白亞基Rm值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，即可繪制出測(cè)定蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)線圖。3、計(jì)算未知蛋白亞基樣品分子量：依據(jù)未知樣品樣Rm值，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中即可查出其分子量。77/96試驗(yàn)三DNS法測(cè)定還原糖一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握還原糖定量測(cè)定原理和方法二、原理在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒?，烯二醇可?，5－二硝基水楊酸（DNS）氧化為糖酸，加熱深入產(chǎn)生一個(gè)紅棕色氨基化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色深淺程度與還原糖量成正比，以此測(cè)定糖量。78/96三、操作步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制詳見(jiàn)教材2、還原糖制備樣品：蘋(píng)果濾液測(cè)定前稀釋4倍其余操作見(jiàn)教材3、樣品酸水解和總糖提取濾液測(cè)定前稀釋2倍其余操作見(jiàn)教材4、蘋(píng)果樣品中總糖和還原糖測(cè)定詳見(jiàn)教材79/96試驗(yàn)四多酚氧化酶制備、性質(zhì)和影響原因一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)從組織細(xì)胞中制備酶方法掌握多酚氧化酶作用、化學(xué)性質(zhì)及影響原因二、原理多酚氧化酶催化兒茶酚氧化成兒茶醌，深入聚合成褐色物質(zhì)；經(jīng)過(guò)反應(yīng)液顏色改變可大致判斷反應(yīng)程度，進(jìn)而推測(cè)酶作用及活力大小；酶是生物催化劑，易受到各種原因影響，如溫度、pH、底物濃度、酶濃度等。80/96三、操作步驟1、酶制備150g土豆（3組）150mLNaF溶液勻漿四層紗布過(guò)濾每組取50mL16g固體硫酸銨4℃30min離心15min4000r/min沉淀溶于15mL緩沖液中粗酶液81/962、多酚氧化酶作用三、操作步驟酶液鄰苯二酚水現(xiàn)象管115d15d管215d15d管315d15d37℃水浴反應(yīng)，每間隔5min振蕩，觀察顏色改變，共25min。82/963、多酚氧化酶化學(xué)性質(zhì)三、操作步驟酶液變性劑鄰苯二酚反應(yīng)現(xiàn)象管115d15d37℃水浴10min管210d10d三氯乙酸，2min10d37℃水浴10min管315d苯硫脲結(jié)晶，5min15d37℃水浴10min37℃水浴反應(yīng)，10min。83/964、底物專(zhuān)一性三、操作步驟酶液鄰苯二酚間苯二酚對(duì)苯二酚現(xiàn)象管115d15d管215d15d管315d15d37℃水浴反應(yīng)，每間隔5min振蕩，觀察顏色改變，共25min。84/965、底物濃度影響三、操作步驟37℃水浴反應(yīng)，1min。酶液鄰苯二酚水反應(yīng)現(xiàn)象管15d1d39d37℃水浴1min管25d10d30d37℃水浴1min管35d40dd37℃水浴1min85/966、酶濃度影響三、操作步驟37℃水浴反應(yīng)，2min。酶液鄰苯二酚水反應(yīng)現(xiàn)象管115d15d37℃水浴2min管21d15d14d37℃水浴2min86/967、H+濃度影響三、操作步驟37℃水浴反應(yīng)，5min。0.8%HCl0.3%乳酸0.2%乳酸0.01%Na2CO30.5%Na2CO3酶液鄰苯二酚現(xiàn)象管140d8d7d管240d8d7d管340d8d7d管440d8d7d管540d8d7d87/96試驗(yàn)五堿性蛋白酶活力測(cè)定（福林－酚試劑法）一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白酶活力方法掌握分光光度計(jì)原理和使用方法二、原理酪蛋白蛋白酶酪氨酸比色測(cè)定鉬藍(lán)鎢藍(lán)酪氨酸福林－酚88/961、樣品處理三、操作步驟詳見(jiàn)教材2、比色測(cè)定4支試管，分別加入1mL酶液40℃預(yù)熱2－3min空白管①平行管②③④1mL2%酪蛋白40℃，10min1mL2%酪蛋白40℃，15min2mL三氯乙酸40℃，15min2mL三氯乙酸40℃，10min過(guò)濾，分別取1mL濾