病毒性腦炎檢測課件

病毒性腦炎檢測王環(huán)宇中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒性腦炎室DepartmentofViralEncephalitisInstituteforViralDiseaseControlandPreventionChinaCDC病毒性腦炎檢測王環(huán)宇1

是指病毒感染引起的腦實質(zhì)炎癥，常表現(xiàn)為發(fā)熱，頭痛，抽搐，意識障礙和腦膜刺激癥狀等，并可有中樞神經(jīng)系統(tǒng)局灶性損害，預(yù)后不佳，死亡率較高，存活者可出現(xiàn)后遺癥，如乙型腦炎病人的后遺癥可達30％。病毒性腦炎Viralencephalitis是指病毒感染引起的腦實質(zhì)炎癥，常表現(xiàn)為發(fā)熱，頭痛，2全世界大約有100余種病毒可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染，患病率約為3.5-7.4/10萬人，粗略估計每年大約有15-30萬病毒性腦炎病毒性腦炎可分為流行性和散在性兩種具有傳播媒介的病毒性腦炎：如乙型腦炎、東方、西方和委內(nèi)瑞拉馬腦炎或呼吸道傳播的腦炎等散在型腦炎：皰疹或風疹病毒等引起我國近年也發(fā)現(xiàn)多起腸道病毒性腦炎的流行此外國際間發(fā)現(xiàn)多種引發(fā)腦炎的新病毒,如尼帕病毒（Niphavirus）性腦炎等新發(fā)傳染病(Emergeningdiseases），還有一些以前從不引起腦炎的病毒如登革熱病毒也出現(xiàn)腦炎的癥狀病毒性腦炎Viralencephalitis全世界大約有100余種病毒可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染，患3由于受檢測技術(shù)的限制，能夠作出病原診斷的只有40％左右，大部分病例依靠臨床診斷病毒性腦炎檢測LaboratoryconfirmationforViralencephalitis由于受檢測技術(shù)的限制，能夠作出病原診斷的只有40％左4血清、腦脊液Serum,CSF蚊蟲、組織標本Mosquitopools,Tissues病原體檢測IgMELISAIgGELISA中和實驗

PRNT補體結(jié)合實驗

CF血凝抑止實驗

HI間接免疫熒光法

IFA病毒分離（細胞、乳鼠）Virusisolation(cellculture,mice)間接免疫熒光法IFA逆轉(zhuǎn)錄PCR/序列測定RT-PCR/sequencing適時熒光PCR法TaqManRT-PCR病毒性腦炎的檢測方法DiagnosticAssaysforViralencephalitis血清學實驗檢測抗體SerologicalAssaysforAntibodiesVirusDetectionAssays血清、腦脊液Serum,CSF蚊蟲、組織標本病原體檢測Ig5病毒性腦炎的實驗室檢測

LaboratoryTestingforViralencephalitis患者診斷

HumanDiagnosis急性期血清、腦脊液中IgM抗體檢測AcuteAntibody(IgM)inserum/csf恢復(fù)期血清標本的中和抗體檢測

IgGand/orneutralizingantibody(seroconversion)病毒分離

Occasionallyvirusinserum/csfand/orintissues/fatalcases周圍環(huán)境的監(jiān)測EnvironmentalSurveillance自然界蚊蟲媒介中病毒分離Virusinmosquitovectors擴增宿主中病毒分離

Virusinhosts擴增宿主中抗體監(jiān)測

Antibodyinhosts病毒性腦炎的實驗室檢測

LaboratoryTesting6BHK-24hBHK-48hBHK-P3-24hBHK-72hBHK-P3-48hBHK-P3-72hBHK-LN02-104-48hBHK-LN02-104-72hBHK-LN02-104-24hC6/36-24hC6/36-48hC6/36-P3-24hC6/36-72hC6/36-P3-48hC6/36-P3-72hC6/36-LN02-104-48hC6/36-LN02-104-72hC6/36-LN02-104-24h

病毒分離

BHK-21

細胞

C6/36細胞乳鼠3-4天，發(fā)病死亡病毒分離及鑒定MethodsforIsolationandIdentificationBHK-24hBHK-48hBHK-P3-24hBHK-727血清學檢測

SerologyELISA檢測IFA檢測(×40)ABCD采用3種抗體用ELISA方法乙腦病毒多克隆抗體甲病毒多克隆抗體布尼亞病毒多克隆抗體血清學檢測ELISA檢測IFA檢測(×40)AB8選擇其它的IgMELISA試劑盒檢測包括：巨細胞病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、帶狀皰疹病毒、人類皰疹病毒6、腮腺炎病毒、麻疹病毒、科薩奇病毒、艾柯病毒TheotherIgMELISAkitsfornon-JEV

IncludingCMV,HSV,EBV,VZV,HHV-6,Mumps,Measles,COX,Eco.血清學檢測

Serology選擇其它的IgMELISA試劑盒檢測血清學檢測9感染診斷，為治療提供依據(jù)；病毒載量（預(yù)后、治療效果）；難以培養(yǎng)的病毒檢測（例如引起腦炎的CMV很難從CSF中培養(yǎng)出來，可用PCR檢測，通過PCR定量，可以區(qū)分是CNS感染或無癥狀感染前期）；監(jiān)測鑒定病毒，幫助制定控制蚊子的措施；分子流行病學調(diào)查；發(fā)現(xiàn)未知病毒病毒分子生物學檢測感染診斷，為治療提供依據(jù)；病毒分子生物學檢測10披膜病毒科甲病毒屬（Alphavirus）黃病毒科（Flaviridae）布尼亞病毒科（Bunyaviridae）呼腸孤病毒科（Reoviridae）分子生物學鑒定的基礎(chǔ)－

病毒特有的基因組序列披膜病毒科甲病毒屬（Alphavirus）分子生物11黃病毒科與疾病相關(guān)的黃病毒：乙型腦炎病毒，登革熱病毒，蜱傳腦炎(TBE)，西尼羅熱病毒，圣路易腦炎，Rocio腦炎黃病毒科病毒中的蟲媒病毒有多種與腦炎相關(guān)以乙腦病毒為例，單股正鏈的RNA分子，約由11000個核苷酸組成4個部分：5’NTR，病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，3’NTR病毒RNA分子5’末端有Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)（M7G(5’)ppp(5’)ApUp)，3’末端不含多聚腺苷酸（polyA）尾黃病毒之間也存在著明顯的血清學交叉反應(yīng)。CPrMENS1NS3NS2bNS2aNS4aNS4bNS55’UTR3’UTR乙腦病毒基因組結(jié)構(gòu)黃病毒科與疾病相關(guān)的黃病毒：乙型腦炎病毒，登革熱病毒，蜱傳腦12披膜病毒科甲病毒屬An5’UTR3’UTRnsP1CapPE2nsP2nsP3nsP46KE1SgP甲病毒基因組結(jié)構(gòu)披膜病毒科（Togaviridae）甲屬病毒（Alphavirus）主要為蚊傳病毒，目前發(fā)現(xiàn)30種甲病毒，其中14種可引起人畜疾病。甲病毒基因組為長約12K的單股正鏈RNA，具感染性。病毒RNA

具有真核mRNA的典型特征，序列的兩端彼此互補，因而病毒RNA能形成環(huán)狀分子（與病毒復(fù)制和包裝有關(guān)）甲病毒屬內(nèi)存在著血清學交叉，影響病毒的血清學精確鑒定與腦炎相關(guān)的甲病毒：東方馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒披膜病毒科甲病毒屬An5’UTR3’UTRnsP1CapPE13布尼亞病毒科48621100.5KbBunyavirusPhlebovirusNairovirusUukuniemi布尼亞病毒RNA節(jié)段大小布尼亞病毒科是目前數(shù)量最多的一組蟲媒病毒，其中約有40多種病毒對人畜致病。5個屬：布尼亞病毒屬（Bunyavirus），白蛉熱病毒屬（Phlebovirus），內(nèi)羅畢病毒屬（Nairovirus），烏庫病毒屬（Uukuniemi），類布尼亞病毒屬(Bunyavirus-like)布尼亞病毒科病毒基因(白蛉熱病毒屬為例)組由3個單股負鏈RNA片段組成：大(Large,L,6.5-8.5kb)，中(Medium,M,3.2-4.3kb)，小(Small,S,1.7-1.9kb)S片段編碼核蛋白(nucloeprotein,N)和非結(jié)構(gòu)蛋白NSsM片段先翻譯出前體多聚蛋白，而后裂解和糖基化形成糖蛋白Gl和G2L片段包含一個與病毒序列互補的ORF，編碼L蛋白，為RNA聚合酶。布尼亞病毒科48621100.5BunyavirusP14每種方法各有優(yōu)勢，依據(jù)病毒及目的來定檢測策略分子生物學檢測方法蚊蟲標本血清CSF尸檢組織標本PCRRT-PCR/sequencingTaqManRT-PCRDNAmicroarrayNASBALAMP……靈敏、特異、快速等特點RNA/DNA

提取核酸擴增結(jié)果檢測樣品(RNA反轉(zhuǎn)錄)每種方法各有優(yōu)勢，依據(jù)病毒及目的來定檢測策略分子生物學檢測方15分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PCRRT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PCRRT-PCR是將RN16實驗?zāi)繕嘶騾^(qū)段的選擇保守性特異性代表性以乙型腦炎病毒的基因分型為例：目標基因區(qū)核苷酸位置（PreM）：456—695；240個核苷酸長度的序列中的差異一般發(fā)生于核苷酸密碼子的第三位，即突變的位點多以沉默突變的形式存在；表明病毒基因在這一區(qū)域所受的進化選擇壓力小，該區(qū)域較能反應(yīng)病毒的自然進化狀況；基因分型的cut-off值定為12%的差異度。4.可根據(jù)文獻進行目標區(qū)段選擇分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PCR實驗?zāi)繕嘶騾^(qū)段的選擇保守性分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PC17PCR結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳觀察

—定性結(jié)果分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PCRPCR結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳觀察

—定性結(jié)果分子檢測18PCR/RT-PCR方法的優(yōu)點方便、快速，一個工作日內(nèi)就可完成；靈敏、特異，對病毒檢測靈敏度可達5pfu/mlPCR除了對單一致病因子的檢測外，還可進行復(fù)合檢測，即在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段，可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體PCR/RT-PCR方法的局限性：逆轉(zhuǎn)錄效率受限制，導致靈敏度有所降低，PCR容易污染而導致假陽性，使特異性降底另外一些問題，如標準化等問題還沒有解決分子檢測技術(shù)

PCR/RT-PCRPCR/RT-PCR方法的優(yōu)點分子檢測技術(shù)

PC19實時熒光PCR

Real-timePCR在同一個密閉反應(yīng)管加入熒光標記探針或熒光染料到PCR擴增反應(yīng)體系，通過熒光信號反映體系的擴增情況，運用一種特殊的裝配有荷電偶聯(lián)裝置（ChargecoupleddeviceCCD）的PCR儀,在每個循環(huán)的采集熒光信號動態(tài)監(jiān)測PCR全過程的一種體外擴增檢測模式稱為實時熒光PCR。實時熒光PCR

Real-timePCR在同一個密20TaqManPCR

一種實時熒光核酸擴增檢測技術(shù)TaqManPCR

是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)原理的實時熒光PCR方法，通過檢測熒光強度的動態(tài)變化得到擴增曲線和循環(huán)閾值（Ct），對待檢樣品進行定性、定量分析的核酸擴增檢測技術(shù)。1.探針：兩端標記熒光素的探針（5’FAM3’TAMRA)2.PCR儀：裝配有荷電偶聯(lián)裝置（ChargecoupleddeviceCCD）的PCR儀,CCD能夠按照一定的時間周期檢測收集熒光信號，由此將擴增與檢測結(jié)合在一起。

ABI7000/7900RocheLightCyclerTaqManPCR

一種實時熒光核酸擴增檢測技術(shù)21TaqManPCRTaqManPCR22Real－timePCR與傳統(tǒng)PCR比較與普通PCR檢測相比，實時熒光PCR具備幾個方面的優(yōu)勢：由于實時熒光PCR采用封閉的檢測模式，因此擴增產(chǎn)物導致污染的可能性比普通PCR要小得多實時熒光PCR檢測模式功能強大，具備定性、定量、突變、多項目等檢測功能。而普通PCR要完成上述項目需采用不同的技術(shù)平臺由于擴增產(chǎn)物的檢測在PCR擴增過程中同時進行，并且數(shù)據(jù)的采集、分析全部由儀器自動完成，因此整個檢測所需的時間比普通PCR要節(jié)省許多實時熒光PCR進行定量檢測時，其定量線性范圍（5-6logs）比普通PCR（2-3logs）要寬得多Real－timePCR與傳統(tǒng)PCR比較與普通PCR檢測相23其它的分子檢測技術(shù)

DNA

芯片(DNAmicroarry)滾環(huán)復(fù)制擴增技術(shù)

(RollingCircleAmplification,RCA)連環(huán)恒溫擴增技術(shù)

(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)其它的分子檢測技術(shù)DNA芯片24DNA芯片于上世紀80年代開始開發(fā)（美國，俄羅斯），1989年，AFFYMETRIX

公司制造出了世界上第一塊原位合成基因芯片，目前這個公司是世界上芯片做的最好的，已通過歐盟CE認證和美國FDA認證(臨床)。GenechiporDNAMicroarray是指將大量靶基因或寡核苷酸片段有序的高密度地排列在固定于玻片、硅片等固相載體上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基互補配對原理進行雜交，通過激光共聚焦熒光監(jiān)測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，再經(jīng)計算機軟件處理，從而獲取大量信息DNA芯片

DNAMicroarrayDNA芯片于上世紀80年代開始開發(fā)（美國，俄羅斯），198925滾環(huán)復(fù)制擴增技術(shù)

RollingCircleAmplification(RCA)RCA，噬菌體感染細菌后進行自我復(fù)制的一種普片機制，這種復(fù)制機制可在同溫下對環(huán)狀單鏈DNA序列進行相對無限的單鏈擴增?；跐L環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)下并有相應(yīng)引物存在的條件下才能同溫聚合滾動復(fù)制的特點。首先設(shè)計一個單鏈寡核苷酸，在此單鏈的3‘和5’端各有一段序列可與所檢測基因上一段連續(xù)的靶序列互補。當檢測的DNA或RNA樣品中包含檢測的靶序列時，這段單鏈兩端所擁有的特異互補序列將與之結(jié)合形成局部雙鏈。形成掛鎖式拓撲結(jié)構(gòu)，并在連接酶的作用下將之連接成環(huán)狀。此時預(yù)先設(shè)計的擴增引物便以該環(huán)為模版進行滾環(huán)復(fù)制，形成滾環(huán)的單鏈重復(fù)體。然后另一條相應(yīng)引物再結(jié)合到經(jīng)滾環(huán)復(fù)制后這種重復(fù)拷貝的單鏈產(chǎn)物上進行擴增，這個擴增序列又可成為最初與滾環(huán)結(jié)合的引物模版而進行新一輪擴增，將這種擴增形式也稱作支鏈放大。滾環(huán)復(fù)制擴增技術(shù)

RollingCircleAmpli26DNAMicroarray技術(shù)的優(yōu)勢：高通量，發(fā)現(xiàn)未知病原體，例如確定SARS-CoV應(yīng)用了DNAMicroarray技術(shù)（ANovelCornoavirusAssociatedwithSevereAcuteRespiratorySyndrome.TheNewEnglandJournalofMedicine,May15,2003,348(20)）。DNAMicroarray目前的不足：費用高，周期長，步驟復(fù)雜，重復(fù)性差，標準化也不理想，但是很有前景。目前用于腦炎相關(guān)病毒檢測的芯片不多，如WestNile,Japaneseencephalitis(JE),dengue1-4viruses（JMedVirol.2005）,Alphavirus例如：甲病毒屬基因檢測芯片：Designedoligomicroarraybyanalyzingallalphavirussequences.

DesignedconsensusamplificationprimerswithinNSP4.Printed12,000unique&consensusoligo’s(35mers)withinthisregiononastandardslidearray.DNA芯片

DNAMicroarrayDNAMicroarray技術(shù)的優(yōu)勢：高通量，發(fā)現(xiàn)未知病原27LAMP技術(shù)，是一種特殊的等溫核酸擴增技術(shù)，2000年初由日本人發(fā)明（NucleicAcidsRes.2000June15;28(12):e63.），實驗中通過設(shè)計一對特殊的引物和一對普通引物，該對特殊的引物在特異擴增中可與產(chǎn)物形成一個回文環(huán)，這對引物又可以與形成的回文環(huán)核酸產(chǎn)物在同溫狀態(tài)下進行相對無限的置換擴增。最終，擴增產(chǎn)物在核酸電泳膠上形成連續(xù)的梯狀條帶這項技術(shù)與其它常規(guī)的核酸擴增技術(shù)相比，具有特異性強、靈敏度高、檢測快速方便，硬件設(shè)施要求低等特點。檢測時間可縮短到兩小時內(nèi)，靈敏度可達到檢測10個以下拷貝的病毒核酸分子。除了應(yīng)用一些常用聚合酶外對硬件設(shè)施基本無特殊要求，在普通的生物學實驗室就可以完成。在實驗實施過程中只需要一步就可以完成操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的質(zhì)控工作。連環(huán)恒溫擴增技術(shù)

Loop-mediatedisothermalamplification,LAMPLAMP技術(shù)，是一種特殊的等溫核酸擴增技術(shù)，2000年初由日28D2Strains,Bitingmidge,2002,G32Strains,Ae.vexans,2002,G31Strain,Humanbrain,1950s,G31Strain,Humanbrain,1960s,G31Strain,Culexmodestus,2002,G11Strain,Culexpipienspallens,2002,G11Strain,Humanbrain,1971,G32Strains,Humanbrain,1949,G3Beijing-1andP31Strain,

Humanbrain,1960s,G31Strain,

Mosquitopool,1960,G3Vaccine---SA14-14-23Strains,Culex,2004,G17Strains,Culextritaeniorhynchus,2001,G19Strains,Culextritaeniorhynchus,2003,G13Strains,Culextritaeniorhynchus,2004,G31Strain,Culextritaeniorhynchus,2005,G11Strain,Humanbrain,1987,G35Strains,Culex,1Strain,Armigeres,2004,G11Strain,Humanbrain,1957,G33Strains,Culex,2strains,Armigeres,2004,G32strains,Armigeres,2004,G31strain,Mosquitopool,2strains,Humanbrain,1954,G34strains,Humanbrain,1strain,Humanblood,1955,G31strain,Humanbrain,1957,G35strains,Humanblood,1strain,HumanCSF,2002,G311strains,Humanblood,2003,G31strain,Humanbrain,1954,G3

8strains,1979,1980s,G11strain,Mosquitopool,1998,G312strains,Mosquitopools,2004,G320strains,Culextritaeniorhynchus,2005,G13strains,Armigeres,2005,G12strains,Culextritaeniorhynchus,2006,G13strains,Culextritaeniorhynchus,2005,G12strains,Cule