空間誘變粵香占和青華占高代品系抗水稻穗頸瘟的ssr多態(tài)性分析

空間誘變粵香占和青華占高代品系抗水稻穗頸瘟的ssr多態(tài)性分析

由真菌馬格拉姆引起的水稻水稻災(zāi)害是全球毀滅性疾病之一，往往會造成嚴重的經(jīng)濟損失。這是阻礙水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要原因之一?？共⌒杂N和使用是最經(jīng)濟有效、最環(huán)保的防治策略。世界各主要產(chǎn)稻國家都選育了許多抗病品種和中間親本,獲得大面積推廣種植和應(yīng)用。我國自20世紀60年代開始注意品種抗性的研究,選育出廣陸矮、珍秈97和窄葉青等抗性品種,20世紀70年代以來篩選出紅腳占等抗源和珍龍13等許多直接利用的品種,但是許多抗病品種在推廣幾年之后就喪失了抗性。因此,如何尋找新抗源、改良品種的抗病持久性是當(dāng)前稻瘟病抗病育種的關(guān)鍵?？臻g誘變育種是近十多年來涌現(xiàn)出來的創(chuàng)造新種質(zhì)和培育新品種的一種新方法,因其可以獲得在地面上用其他育種方法難以得到的罕見突變體,為獲得新的抗病種質(zhì)資源提供了快速有效的途徑?？臻g誘變稻瘟病抗性變異的機制是復(fù)雜的,需要系統(tǒng)地從不同水平上進行研究。目前國內(nèi)在培育抗稻瘟病新品種和選育新抗源方面做得較多,而對誘變品系的生理生化和分子生物學(xué)方面的研究較少。作者前一階段研究已對經(jīng)過高空氣球搭載后的水稻誘變品系進行了稻瘟病抗譜測定,證明空間誘變可以獲得對稻瘟病苗葉瘟表現(xiàn)高抗的抗病種質(zhì),本論文報道了空間誘變品系的穗頸瘟鑒定試驗結(jié)果,并采用SSR標(biāo)記技術(shù)對水稻空間誘變抗病材料進行分子標(biāo)記研究。1材料和方法1.1應(yīng)用抗誘變株的篩選及篩選將高感稻瘟病品種粵香占和青華占品種的種子分別于1998年和1999年利用高空氣球搭載進行空間誘變,誘變后的種子經(jīng)過田間單株種植,對特大穗、特高產(chǎn)、特優(yōu)質(zhì)、高分蘗等農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異的突變株進行選育,并經(jīng)過多代(6代以上)繁殖,最終獲得20份農(nóng)藝性狀優(yōu)異的粵香占誘變品系和35份青華占誘變品系。從中隨機選擇11份粵香占和10份青華占誘變品系作為本研究的材料,原種粵香占和青華占做對照。1.2葉疫和穗頸當(dāng)前發(fā)病情況將空間誘變品系與原種對照同時種植于稻瘟病代表性病圃,即粵北山區(qū)的雜交稻稻區(qū)從化呂田,該病圃為稻瘟病常發(fā)區(qū)。每品種(系)種5行,每行5叢,周邊插植2行高感稻瘟病品種CO39。分期調(diào)查葉瘟和穗頸瘟發(fā)病結(jié)果。穗瘟調(diào)查病級分為0～9級,其中0級:無病;1～2級:發(fā)病率<5%;3～4級:發(fā)病率5.1%～10.0%;5級:發(fā)病率10.1%～25.0%;6～7級:發(fā)病率25.1%～50.0%;8～9級:發(fā)病率50.1%～100.0%。將病級為0～2級的定為高抗,3～4級的為抗病,5級的為中抗至中感,6～7級為感病,8～9級為高度感病。1.3研磨石英砂、去干活性水稻總DNA的提取按Zheng等的簡易SDS抽提法稍加修改進行。方法如下:取水稻苗期幼葉2～3片于研缽中,加400μLSDS抽提液(200mmol/LTris-HCl,pH7.5、25mmol/LNaCl、0.5%SDS),再加入少許石英砂,研磨成綠色漿狀,轉(zhuǎn)移至2mL離心管中,用400μL抽提液洗凈研缽,洗液一同倒入離心管中,放置約1h。加入氯仿/異戊醇(V∶V=24∶1)約1mL,振蕩45min,充分混勻后于14000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移到另一1.5mL離心管中,加入等體積冰凍乙醇,-20℃下放置15min析出DNA,14000r/min離心3min,去上清液,用75%乙醇漂洗,適當(dāng)風(fēng)干,加200～300μLTE(10mmol/LTris-HCl、pH8.0、1mmol/LEDTA)溶解。1.4pcr擴增所用引物根據(jù)Cornell大學(xué)(網(wǎng)址:/rice/microsat)公布的序列,由上海生工公司合成,共150對,均勻地分布于水稻的12條染色體上。PCR反應(yīng)在PE9700熱循環(huán)儀上進行。PCR反應(yīng)體系(20μL)中含有:1×PCRbuffer(50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl,pH8.3,1.5mmol/LMgCl2,0.1%明膠),1UTaqDNA聚合酶,50～100ng模板DNA,0.15umol/L引物,0.2mmol/LdNTP。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min,(94℃1min,55℃1min,72℃1min)35個循環(huán),72℃再延伸5min。擴增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,0.1%AgNO3染色觀察。1.5相關(guān)分析采用SPSS13.0軟件分析粵香占和青華占誘變品系的抗病性與微衛(wèi)星多態(tài)性頻率的相關(guān)性。2結(jié)果分析2.1空間誘變對自身抗性的影響粵香占和青華占2個水稻品種的種子經(jīng)過高空氣球搭載后,選育出豐產(chǎn)、株型、分蘗力等農(nóng)藝性狀表現(xiàn)比原種提高的空間誘變高代(6代以上)品系,在上階段研究中,作者采用36個廣東省稻瘟病菌不同致病型的代表菌株分別對粵香占和青華占及其空間誘變品系進行抗譜測定,研究結(jié)果表明粵香占和青華占種子經(jīng)空間誘變后,對稻瘟病的抗性產(chǎn)生了變異,有些品系抗性水平提高了,有些品系變得更感病了,證明空間誘變可以獲得對稻瘟病苗葉瘟表現(xiàn)高抗的抗病種質(zhì)。選取部分空間誘變品系種植于從化呂田病圃進行穗頸瘟試驗,結(jié)果顯示11個粵香占空間誘變品系中表現(xiàn)高抗稻瘟病的有YX05、YX06、YX073個品系,抗病的有YX11品系,中抗的YX01和YX042個品系,原種粵香占表現(xiàn)高感稻瘟病;10個青華占空間誘變品系中表現(xiàn)高抗稻瘟病的有QH02、QH03、QH04、QH05和QH105個品系,而青華占原種高感稻瘟病(表1)。田間試驗結(jié)果與室內(nèi)抗譜測定結(jié)果基本一致,說明粵香占和青華占種子經(jīng)空間誘變后,對稻瘟病的抗性產(chǎn)生了明顯的變異,表明空間誘變確實可以獲得抗稻瘟病品系。2.2空間誘導(dǎo)變量系的分子標(biāo)記研究2.2.1突變片段的記錄采用150對引物分別對粵香占和青華占突變品系進行擴增(表2、表3),與原種相比,突變株中擴增片段的微衛(wèi)星多態(tài)性主要表現(xiàn)為以下3種形式:(1)擴增片段(電泳譜帶)數(shù)的增多,突變品系增加了某些片段;(2)片段數(shù)的減少,突變品系缺少了某些片段;(3)擴增片段長度的差異,擴增片段的長度發(fā)生了變化(圖1)。同一標(biāo)記在同一系列的突變體中擴增片段往往具有同樣的多態(tài)性表現(xiàn)形式。如RM9在10個粵香占突變品系中具有多態(tài)性,并且其多態(tài)性都是以擴增片段長度差異的形式表現(xiàn);不同微衛(wèi)星標(biāo)記在同一突變品系中具有不同的表現(xiàn)形式。本研究粵香占突變品系3種形式的多態(tài)性所占的比例分別為16.2%、9.9%、73.9%,而青華占突變品系的為11.2%、25.0%、63.8%。2.2.2青華占突變品系檢測在所用的150對引物中,共有125對引物得到有效擴增,擴增產(chǎn)物的大小介于100～350bp之間。有效擴增的引物中,有32對引物能夠在11個粵香占突變品系中檢測出多態(tài)性,各個突變品系與原種間的多態(tài)性頻率為1.6%～17.6%;有24對引物在10個青華占突變品系中檢測出多態(tài)性,各個突變品系與原種間的多態(tài)性頻率為7.2%～10.4%。說明空間環(huán)境確實能使水稻基因組多個位點同時發(fā)生突變。對粵香占突變品系中能檢測出多態(tài)性的32對引物與青華占突變品系中能檢測出多態(tài)性的24對引物進行比較發(fā)現(xiàn),它們當(dāng)中有20對引物是相同的。并且這20對引物中有一部分引物能同時檢測出多個突變品系與原種間的多態(tài)性。例如,引物RM9能夠檢測出10個粵香占突變品系與原種間的多態(tài)性和6個青華占突變品系與原種間的多態(tài)性,引物RM335能檢測出7個粵香占突變品系和10個青華占突變品系與原種間的多態(tài)性。這是否意味著這20對引物所在的DNA位點可能在空間環(huán)境下容易產(chǎn)生變異。有關(guān)水稻DNA序列中是否存在脆弱位點在空間環(huán)境下容易產(chǎn)生變異將有待進一步研究。2.3田間穗頸景觀抗性表現(xiàn)將粵香占和青華占空間誘變品系的微衛(wèi)星多態(tài)性與抗病性進行比較,發(fā)現(xiàn)部分誘變品系的微衛(wèi)星多態(tài)性頻率越高,其抗病性越高。如粵香占和青華占的誘變品系中多態(tài)性頻率最低的YX09(1.6%)和QH07(7.2%)表現(xiàn)出高感穗頸瘟,其病級均為8級。而多態(tài)性頻率最高的粵香占誘變品系YX06(17.6%)的田間穗頸瘟抗性表現(xiàn)高抗,病級為1級。在青華占誘變品系中多態(tài)性頻率最高的QH04(10.4%)和QH10(10.4%)同樣也表現(xiàn)出高抗穗頸瘟(病級1級)。但并非所有的誘變品系的抗病性隨著微衛(wèi)星多態(tài)性頻率的增加而提高。如多態(tài)性頻率均為13.6%的粵香占誘變品系YX02和YX08卻高感穗頸瘟,病級分別為8和9級。對粵香占和青華占空間誘變品系的抗病性和微衛(wèi)星多態(tài)性頻率的相關(guān)分析表明兩者的相關(guān)系數(shù)分別為-0.382(R0.05=-0.576)和-0.455(R0.05=-0.602)。雖然兩者的相關(guān)性均未達到顯著水平,但根據(jù)相關(guān)系數(shù)可知誘變品系的抗病性與微衛(wèi)星多態(tài)性頻率存在一定的負相關(guān)。由于空間誘變引起的變異是多方面的,有農(nóng)藝經(jīng)濟性狀的變異,也有抗性基因的變異,本研究只隨機選取了較均勻分布于水稻12條染色體的150對引物,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)空間誘變品系的微衛(wèi)星多態(tài)性與其抗病性存在一定的相關(guān)性,但要系統(tǒng)研究兩者之間的對應(yīng)關(guān)系,還必須有目的地篩選出更多與抗病基因標(biāo)記有關(guān)的SSR標(biāo)記。3空間誘變抗病性基因與抗性菌株間的相互作用本文的前期研究已證明空間誘變能夠獲得抗稻瘟病苗葉瘟的新種質(zhì)。在此基礎(chǔ)上,本研究通過病圃田間穗頸瘟試驗,發(fā)現(xiàn)空間誘變抗病品系不僅具有苗期抗性,而且具備成熟期抗性,有些品系從苗期至成熟期均表現(xiàn)高抗稻瘟病,研究結(jié)果從表型上證明了空間誘變確實能使水稻產(chǎn)生抗性變異,同時這種變異能夠穩(wěn)定的遺傳給后代。隨著分子標(biāo)記的發(fā)展,各種DNA標(biāo)記已被應(yīng)用于突變體的研究,對于空間誘變植物突變體的分子生物學(xué)研究及其誘變突變機理的研究報告不多。Hong等對空間誘變麗江新團黑谷抗稻瘟病品系開展抗性遺傳分析,發(fā)現(xiàn)空間誘變抗病株系SP2代植株對接種菌株的抗感分離比例多數(shù)符合3∶1或15∶1的規(guī)律,說明多數(shù)誘變抗病株系受1對或2對顯性主效基因控制,采用SSR標(biāo)記對其中的誘變抗病株系LR8-SP2的抗病基因進行分子標(biāo)記,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因位于第9染色體上,與微衛(wèi)星標(biāo)記RM409連鎖;由于麗江新團黑谷是國際公認的對稻瘟病不具有抗病基因的普感品種,研究結(jié)果證明了空間誘變確能使水稻植株產(chǎn)生明顯的抗性變異,產(chǎn)生新的抗病基因。Li等采用DD-PCR從空間誘變稻瘟病突變品系972-4及地面對照品系972ck中尋找差異表達基因,發(fā)現(xiàn)2個EST在抗稻瘟病水稻品系972-4中高表達,可能是抗瘟性相關(guān)基因。2個EST在GenBank數(shù)據(jù)庫的序列號分別為AF4484