超低溫保存技術(shù)在愈傷組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

超低溫保存技術(shù)在愈傷組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

干旱治理是水稻科的一種多年生草本植物。它生長在亞洲。它是最耐寒的冷草之一。由于其良好的抗鹽性、抗旱性、低砍伐性和葉片薄等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于城市中心廣場、果嶺草坪發(fā)芽盤、草坪保齡球場等優(yōu)質(zhì)觀賞草和運(yùn)動(dòng)草坪的建設(shè)。近年來，對牙冠抗逆性的研究取得了很大進(jìn)展。其中，生物繁殖技術(shù)為牙冠育種提供了良好的受體系統(tǒng)。然而，根據(jù)研究，在重復(fù)過程中，組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生變化，例如多倍體、非全體、染色體消失和遺傳定位。在離體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的超低溫保存技術(shù),以無菌培養(yǎng)、保存穩(wěn)定、占用空間少等優(yōu)點(diǎn)在植物種質(zhì)資源的長期保存中受到了人們的重視,得到了廣泛的應(yīng)用.玻璃化法超低溫保存是80年代發(fā)展起來的一種冷凍新技術(shù),具有設(shè)備簡單、操作方便、冷凍效果好等優(yōu)點(diǎn).如果能用超低溫技術(shù)來長期、穩(wěn)定地保存遺傳轉(zhuǎn)化受體材料,將為草坪草的細(xì)胞工程和基因工程操作帶來很大的方便.但目前有關(guān)草坪草超低溫保存方面的研究還未見報(bào)道,因此,本研究對匍匐翦股穎愈傷組織的玻璃化法超低溫保存和植株再生條件進(jìn)行了初步探討,以期為玻璃化法超低溫保存技術(shù)在植物種質(zhì)資源的保存中的應(yīng)用提供理論依據(jù).1材料和方法1.1試驗(yàn)材料匍匐翦股穎品種為優(yōu)質(zhì)品種A-4,由北京克勞沃公司提供.1.2測試方法1.2.1水養(yǎng)蛋白水白水3.2%水以A-4種子為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),并進(jìn)行繼代培養(yǎng).愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4mg·L-12,4-D+0.1mg·L-16-BA+300mg·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂,pH5.8,培養(yǎng)溫度(25±2)℃,黑暗中培養(yǎng);繼代培養(yǎng)基為MS+2mg·L-12,4-D+0.1mg·L-16-BA+0.3mg·L-1-NAA+300mg·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂,pH5.8,培養(yǎng)溫度(25±2)℃,黑暗中培養(yǎng).1.2.2根系開挖和疾病的組織玻璃化超過低溫保存1.2.1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿中挑選出結(jié)構(gòu)松脆、生長旺盛、色澤鮮艷的愈傷塊轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)基上,4℃培養(yǎng)1~7d.預(yù)培養(yǎng)基為MS+2mg·L-12,4-D+蔗糖(濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol·L-1)+7g·L-1瓊脂.1.2.1.moll-1甘油+0.4mol-1蔗糖蔗糖參照郭玉瓊等的方法并加以改進(jìn).將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的匍匐翦股穎胚性愈傷組織移入1.8mL凍存管中,0.3g·管-1.于常溫下用裝載液(2mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖)分別處理10、20、30、40、50min;再于0℃下用玻璃化溶液PVS2分別平衡10、20、30、40、50、60min后移去PVS2溶液,加入新鮮的PVS2保護(hù)劑,迅速將冷凍管投入液氮中保存,每一處理重復(fù)3次.PVS2溶液的組成為300g·L-1甘油+150g·L-1乙二醇+150g·L-1DMSO+0.4mol·L-1蔗糖.1.2.1.3冷和冷凍將上述處理后的凍存管快速投入液氮中冷凍1h以上,取出后迅速分別放入10、20、30、40、50℃的水浴中解凍.1.2.1.入蔗糖的培養(yǎng)基當(dāng)凍存管中的冰剛解凍完時(shí)吸去PVS2保護(hù)劑,加入蔗糖(濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol·L-1)和MS基本培養(yǎng)基,洗滌3次,每次洗滌10min.1.2.1.細(xì)胞活力檢測冷凍后細(xì)胞存活率的測定采用TTC法,按Towill和Mzaur方法,稱取洗滌后的愈傷組織200mg,放入具刻度10mL的試管中,加入5mLTTC試劑,22~25℃下靜止黑暗培養(yǎng)18~20h,吸去TTC溶液,用蒸餾水洗滌2-3次,然后加入5mL95%乙醇,將試管放入60℃水浴中加熱20~30min.提取氯化三苯四氮唑被脫氫酶還原生成的紅色甲簪,最后用Specord型分光光度計(jì)在485nm波長處測試吸收值,吸收值表示細(xì)胞的相對活力,3次重復(fù),取平均值.細(xì)胞存活率(%)=處理后細(xì)胞TTC值/未處理細(xì)胞TTC值1.2.1.芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)經(jīng)解凍洗滌后的愈傷組織立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng),培養(yǎng)條件分為2組:一組放于光照(約2500lx)的培養(yǎng)箱中23~25℃培養(yǎng),另一組置于無光照的培養(yǎng)箱中23~25℃培養(yǎng).繼代2次后,進(jìn)行芽的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng),培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA;然后進(jìn)行根的誘導(dǎo),培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg·L-1KT.2結(jié)果與分析2.1低溫培養(yǎng)時(shí)間對流變理解的影響抗寒力的提高與細(xì)胞的分裂和生長活動(dòng)等各種生理狀態(tài)有密切關(guān)系,同時(shí),預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖濃度對成活率也有著重要影響.一般認(rèn)為,采用低溫連續(xù)培養(yǎng)的方法,可以激活植物體內(nèi)的抗寒機(jī)制,從而提高植物材料對低溫環(huán)境的抗性.此外,高滲培養(yǎng)可以減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量,增加組織中可溶性糖等保護(hù)性物質(zhì)的含量,使細(xì)胞能經(jīng)受低溫脅迫.本研究結(jié)果(圖1)表明,在4℃低溫培養(yǎng)下,隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長,匍匐翦股穎愈傷組織細(xì)胞的存活率逐漸增高,預(yù)培養(yǎng)5d時(shí),超低溫處理的細(xì)胞存活率為82.6%,愈傷組織細(xì)胞具有較高的抗凍能力;超過5d,超低溫保存處理的愈傷組織細(xì)胞存活率逐漸降低,7d時(shí)存活率僅為51.3%.由圖2可以看出,預(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為0.3mol·L-1時(shí),超低溫保存后匍匐翦股穎愈傷組織細(xì)胞存活率最高,可達(dá)85.6%,隨著蔗糖濃度的升高,超低溫保存后細(xì)胞存活率不斷降低.這表明預(yù)培養(yǎng)處理有利于增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒力,提高冷凍后細(xì)胞的存活率,同時(shí)預(yù)培養(yǎng)可改變細(xì)胞的生理狀態(tài),能使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較多的保護(hù)性物質(zhì).2.2不同處理對超低溫保存存活率的影響由于PVS2中含有較高濃度的二甲基亞砜(DMSO),毒性作用比較大,在室溫下易使細(xì)胞受損,因此,本研究在0℃用100%PVS2處理不同的時(shí)間.由圖3可以看出,隨著PVS2處理時(shí)間的延長,超低溫保存后匍匐翦股穎愈傷組織的存活率逐漸升高,PVS2處理50min時(shí),超低溫保存處理的存活率可達(dá)80.7%,超過60min,存活率開始降低.這是由于PVS2的目的是脫去細(xì)胞中過多的水分,使材料能夠完全達(dá)到玻璃化,并使冷凍保護(hù)細(xì)胞液滲入細(xì)胞,減輕在超低溫保存過程中細(xì)胞所受的傷害.處理時(shí)間低于50min,材料中細(xì)胞脫水不足,在超低溫保存中易使細(xì)胞中的水分結(jié)冰,不能達(dá)到玻璃化狀態(tài),使細(xì)胞受損;處理時(shí)間超過50min,PVS2對材料有毒害作用,存活率下降.因此,本研究采用PVS2的脫水時(shí)間為50min.2.3解凍、洗滌、蔗糖濃度對愈傷組織細(xì)胞的影響在超低溫保存過程中,冰凍和解凍都可能使細(xì)胞受凍害,采用適宜的解凍方法才能避免在解凍時(shí)再結(jié)冰或滲透沖擊引起細(xì)胞膜體系的破壞.本研究采用不同的溫度和蔗糖濃度進(jìn)行洗滌,由圖4可以看出,不同解凍溫度對匍匐翦股穎愈傷組織存活率的影響較大.30℃水浴解凍時(shí),愈傷組織細(xì)胞存活率最高,可達(dá)81.4%.隨著溫度不斷升高,細(xì)胞存活率開始降低,40℃時(shí)細(xì)胞存活率低于70%.這可能是匍匐翦股穎愈傷組織冷凍后適合在30℃下解凍,這既可避免高溫化凍使愈傷組織吸水過快造成細(xì)胞質(zhì)壁分離傷害,又可避免溫度過低造成再次結(jié)冰的傷害.由圖5可以看出,洗滌時(shí),蔗糖濃度過高或過低都對愈傷組織細(xì)胞存活不利,只有蔗糖濃度在1.0mol·L-1時(shí),冷凍后細(xì)胞的存活率最高,可達(dá)81.3%.其他研究也表明,洗滌液中蔗糖濃度的高低直接影響材料冷凍后的存活率,這是由于洗滌是為了除去高濃度的冰凍保護(hù)劑,使細(xì)胞能夠維持穩(wěn)定的滲透壓.蔗糖濃度過低,洗滌液的滲透壓低于細(xì)胞,細(xì)胞就會(huì)吸水膨脹而受傷;反之,若蔗糖濃度過高,高滲透壓溶液會(huì)使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離,降低細(xì)胞的存活率.2.4種常用光培養(yǎng)條件對愈傷組織生長的影響將解凍后的愈傷組織轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基上,分為2組,一組放在光培養(yǎng)箱中;另一組放在暗培養(yǎng)箱中,溫度均為25℃.培養(yǎng)40d后,2種情況下的愈傷組織生長表現(xiàn)出明顯的差異.在光培養(yǎng)下的愈傷組織生長緩慢,出現(xiàn)了褐化,存活率僅為39.8%;而培養(yǎng)于黑暗條件下的愈傷組織能較快的恢復(fù)生長,存活率可達(dá)90.1%.這表明植物細(xì)胞組織在遭受冰凍或回復(fù)到正常溫度生長時(shí),黑暗更有利于細(xì)胞組織的恢復(fù)生長;反之,光照不利于凍害細(xì)胞組織的恢復(fù),甚至可能有加重細(xì)胞損傷的趨勢.2.5培養(yǎng)愈傷組織在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),超低溫處理后,愈傷組織會(huì)出現(xiàn)一段時(shí)間的停滯期,直到第3星期,黑暗中培養(yǎng)的一組才恢復(fù)生長,繼代1次后,愈傷組織能夠迅速的生長.之后轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)4星期后有綠芽出現(xiàn),出芽率95%以上.接續(xù)繼代1次后再轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基上,20d就會(huì)有大量的根生成.3冷凍保護(hù)劑對愈傷組織的影響玻璃化超低溫保存是目前發(fā)展較快,應(yīng)用較廣的一種超低溫保存新技術(shù),已經(jīng)成為一種較為理想的保存植物種質(zhì)資源的方法.影響玻璃化超低溫保存效果的因素很多,除了保存材料的特性外,超低溫保存的處理步驟是最主要的影響因素,每一步都會(huì)直接影響到保存的成活率.在進(jìn)行超低溫保存時(shí),預(yù)培養(yǎng)主要是使組織部分脫水和增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,改善材料生理狀態(tài),從而提高組織的抗冷性.預(yù)培養(yǎng)主要有高滲培養(yǎng)和低溫鍛煉兩種,高滲培養(yǎng)主要向培養(yǎng)基中添加高滲透性物質(zhì),一般是以蔗糖作為滲透性保護(hù)物質(zhì),濃度一般為0.1~1.0mol·L-1,也有研究采用甘露醇、山梨醇或5%~10%的二甲基亞砜等作為滲透性保護(hù)劑;低溫鍛煉一般是在2~5℃進(jìn)行培養(yǎng),如Hiral在2℃低溫下將苜蓿懸浮細(xì)胞培養(yǎng)10d,冷凍后細(xì)胞存活率可達(dá)90%,這可能與愈傷組織對低溫環(huán)境具有較好的內(nèi)在適應(yīng)機(jī)制有關(guān).本試驗(yàn)將愈傷組織轉(zhuǎn)接在MS培養(yǎng)基中,附加0.3mol·L-1蔗糖,4℃冰箱中存放5d,冷凍后細(xì)胞的存活率達(dá)到了85.6%.玻璃解凍存的關(guān)鍵在于嚴(yán)格控制植物材料在玻璃化保護(hù)劑中的脫水時(shí)間,材料的最佳脫水時(shí)間具有種的特異性.由于玻璃化溶液中含有較高濃度的DMSO,處理時(shí)間的長短直接影響細(xì)胞的存活率.因此,合適的脫水時(shí)間要根據(jù)不同種植物細(xì)胞膜特性、細(xì)胞大小、細(xì)胞的脫水耐受性及保護(hù)劑的滲透性等多種因素綜合考慮.從本試驗(yàn)來看,在0℃下將愈傷組織在玻璃化溶液PVS2處理50min達(dá)到較好的效果.從已有的報(bào)道來看,不同材料的最適處理時(shí)間相差很大,日本陸生蘭花(Bletillastriata)的合子胚在PVS2中最佳脫水時(shí)間是3h,玉米(ZeamaysL)愈傷組織的最佳脫水時(shí)間為40min,水稻懸浮細(xì)胞則只需7.5min.超低溫保存后的材料在水浴中解凍后,要在適宜濃度的溶液中洗去玻璃化液中的有毒成分,否則,會(huì)因?yàn)橘|(zhì)壁分離復(fù)原太劇烈而加大對細(xì)胞的損傷.也有報(bào)道指出,洗滌會(huì)對細(xì)胞帶來不可避免的傷害,使細(xì)胞發(fā)生去質(zhì)壁分離傷害或產(chǎn)生機(jī)械傷害.本試驗(yàn)比較了不同濃度蔗糖洗滌效果,發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度為1.0mol·L-1時(shí),冷凍后匍匐翦股穎愈傷組織細(xì)胞的存活率最高,比其它組織材料進(jìn)行洗滌時(shí)的蔗糖濃度(1.2mol·L-1)小,這可能與材料的性質(zhì)和脫水時(shí)間有關(guān).生長停滯是許多材料經(jīng)超低溫保存后所面臨的問題,本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),匍匐翦股穎愈傷組織進(jìn)行超低