成骨過程中骨髓基質干細胞與小腸黏膜下復合培養(yǎng)成骨及血管生成的研究

成骨過程中骨髓基質干細胞與小腸黏膜下復合培養(yǎng)成骨及血管生成的研究

骨缺損的恢復是臨床上的難題之一。骨和骨膜移植存在于帶區(qū)損傷和數(shù)量有限的缺點。異體骨移植可能會導致異體異體和感染疾病。利用組織工程技術構建組織工程化骨是修復骨缺損的趨勢。但組織工程用的支架材料必須與細胞具有良好的生物相容性,包括表面相容性和結構相容性,才能有利于細胞的黏附、增殖和分化。同時還要有具有一定空隙和降解速度的三維結構,以利于營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物的滲透交換,以及內皮細胞的黏附和新生血管的長入。小腸黏膜下層(smallintestinesubmucosa,SIS)是一種具有三維結構的細胞外基質材料,與骨膜的主要區(qū)別是不含具有成骨作用的成骨細胞。我們已證實SIS與骨髓基質干細胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有良好的組織相容性。但兩者復合后的成骨及成骨過程的超微結構觀察未見報道。我們將成骨誘導的BMSCs與SIS復合培養(yǎng)2周后構建仿生性組織工程骨膜,植入裸鼠皮下,從超微結構觀察成骨過程中成骨細胞、血管生成的變化及體內成骨的過程,說明組織工程骨膜成骨的可靠性,為以SIS作為支架材料構建組織工程骨膜用以修復骨缺損提供實驗依據(jù)。實驗動物及設備主要儀器和試劑相差顯微鏡(Olympus),掃描電鏡(QuanTa200,Philips-FEI),透射電鏡(JEM-200CX),新生牛血清(杭州四季青生物制品公司),胰蛋白酶、地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉(Sigma),24孔培養(yǎng)板(上海普飛生物技術有限公司),裸鼠(上海市腫瘤研究所提供)。SIS制備1.小鼠的運輸和去污小腸取自體質量至少200kg的封閉飼養(yǎng)的豬,小腸在運輸過程中置于冰中,并且清潔過程在4h內完成,小腸的漿膜層和肌層用裹有紗布的刀柄去除,在去除黏膜和肌層過程中用40℃水持續(xù)沖洗。2.bmscs的制備和生長按Abraham方法制備。將用物理方法處理的小腸在室溫下經(jīng)過一系列的化學方法處理。材料與溶液的體積比保持在1∶100。①將物理方法制得的SIS浸泡在含有100mmol/L乙二胺四乙酸和10mmol/LNaOH溶液(pH11~12)中16h;②用去離子水將基質沖洗干凈,在含有1mmol/LHCl和1mmol/LNaCl溶液(pH0~1)中浸泡6~8h;③用去離子水沖洗基質后,在含1mmol/LNaCl的磷酸緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS)中浸泡16h;④用去離子水沖洗基質后,在PBS(pH7~7.4)中浸泡2h;⑤再用去離子水(pH5.8~7.0)沖洗基質2h;⑥殺菌:將SIS在含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8h,用含0.05%疊氮化鈉的PBS清洗2h,-70℃凍干后用γ射線(25~35kGy)照射消毒。BMSCs的分離和培養(yǎng)取2月齡普通級新西蘭大白兔,體質量1.5~2.5kg,上海申旺養(yǎng)殖場提供,生產(chǎn)許可證號碼:SCXK(滬)2002-0011。經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)全麻。脛骨上段及膝關節(jié)周圍備皮,碘伏消毒皮膚,鋪無菌手術巾,保持無菌狀態(tài)。用小兒骨髓穿刺針接10mL注射器,注射器內含稀釋的肝素鈉2500U/mL,加入2mLPBS混勻。自脛骨上段前內側穿刺抽取骨髓4mL,緩慢注入預先加入4mL淋巴細胞分層液的離心試管中,密度梯度離心(2000×g)20min,吸取單核細胞層,用D-Hanks液洗滌離心(1000×g)2次,每次10min。按1×105/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中,加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液5mL(其中含有青霉素100U/mL,鏈霉素100U/mL,pH7.2~7.4),在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4d,更換培養(yǎng)液,將未貼壁細胞棄掉。繼續(xù)培養(yǎng),每隔3~4d更換1次培養(yǎng)液。相差顯微鏡下觀察,見細胞大部分長滿貼壁后,用0.25%胰蛋白酶消化5min后傳代培養(yǎng)。BMSCs與SIS體外復合培養(yǎng)將傳至第三代、在完全培養(yǎng)基中加入成骨誘導劑(β-甘油酸鈉80μg/mL、地塞米松10mmol/mL、L-抗壞血酸80μg/mL)培養(yǎng)的BMSCs以5.0×105/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板,每孔加1cm×1cmSIS材料1塊,再加入培養(yǎng)基1mL,于37℃、5%CO2飽和濕度條件下復合培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)液。1、2周后取出SIS用于觀察及檢測。另設6個空白對照,材料上不種植細胞。超微結構觀察①掃描電鏡觀察:BMSCs與SIS復合培養(yǎng)第1、2周后,將培養(yǎng)孔內生物材料取出,2.5%戊二醛固定,系列丙酮中脫水,乙酸異戊酯置換,臨界點干燥,表面噴金后掃描電鏡觀察BMSCs在SIS上的附著、生長、分裂和增殖情況。②透射電鏡觀察:BMSCs與SIS復合培養(yǎng)1、2、4周及植入裸鼠體內4、8、12周后,2.5%戊二醛固定,系列丙酮中脫水,浸透及環(huán)氧樹酯包埋,超薄切片機切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色,透射電鏡觀察BMSCs中的細胞器變化情況。bmscs的生長掃描電鏡觀察體外復合培養(yǎng)時,培養(yǎng)7d細胞數(shù)量明顯增多,細胞分泌旺盛,細胞間有大量膠原纖維絲形成細胞間連接。部分細胞跨越孔隙,呈長梭形,有的正在分裂,有的重疊生長(圖1A)。培養(yǎng)10d后細胞數(shù)量增多,連成一片。2周時細胞數(shù)量增加更多,細胞分裂、增殖呈三維生長,細胞分泌大量細胞外基質,呈蜂窩狀,縫隙逐漸被細胞外基質填塞而變得致密,細胞輪廓也變得模糊(圖1B)。透射電鏡觀察體外培養(yǎng)時BMSCs在SIS上呈多層生長,細胞連接緊密。胞體成梭形,膜表面有微絨毛狀突起,細胞核呈梭形或不規(guī)則形,偶見有分葉形,粗面內質網(wǎng)豐富、擴張、增粗,細胞間基質致密,可見鈣化灶形成(圖1C)。復合材料植入體內4周時,見有大量成軟骨細胞和成骨細胞,細胞核較大,細胞內有大量線粒體。以圍繞新形成小血管的成骨細胞最為典型,細胞核較大,胞漿內含擴張的粗面內質網(wǎng)和高爾基體,細胞分泌大量的細胞外基質,間質中有部分鈣化帶形成(圖2A)。此時形成的小血管管周內皮細胞包繞不完整,稱為血管芽。復合材料植入體內8周時,中央部分骨細胞數(shù)量減少,包埋于成熟的細胞外基質中。血管內皮細胞變?yōu)楸馄讲@整個血管腔,成骨細胞周圍已含有大量骨基質(圖2B)。12周時,成骨細胞仍存在,但數(shù)量明顯減少,胞漿中細胞器退化,包埋于成熟的細胞外基質中,有大量的鈣鹽沉積帶(圖2C)。單純SIS植入體內8周,見有血管、成纖維細胞和巨噬細胞形成,未見成骨細胞及成熟骨形成(圖3)。sis與bmscs的作用機制組織工程化組織是細胞與材料的復合體,本身無營養(yǎng)來源,營養(yǎng)物質和氧氣的供應主要依賴滲透和擴散作用。體積大于幾毫米就不能依靠營養(yǎng)的彌散而生存,必須通過血管再生來獲得營養(yǎng)。組織工程骨的血管再生與支架材料的種類和性質密切相關,選擇支架時應考慮與血管內皮細胞生長及毛細血管形成相協(xié)調的材料,支架必須具有一定的孔隙和降解速度以利于血管長入內部。SIS是從豬空腸黏膜下層分離出的無細胞膠原層,是天然細胞外基質類材料,作為可吸收支架和基質材料已廣泛應用于多種組織的修復。SIS這種生物材料更接近于天然結締組織復雜的成分結構,其結構與細胞更具親和力,有良好的細胞相容性,并且含有血管內皮細胞生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子-2、轉化生長因子-β等多種生長因子。當SIS植入宿主體內后,能迅速誘導細胞浸潤,刺激血管生成和宿主細胞的長入、分化。產(chǎn)生的再生組織在結構和功能上與原有組織相似,能為宿主細胞提供可吸收支架材料,基本能滿足對生物支架材料的要求,最終達到修復組織缺損的目的。SIS含有超過90%的Ⅰ型和Ⅲ型膠原。Ⅰ型膠原是骨有機質的主要成分,在體內為鈣鹽的沉積提供支架。同時體外實驗中,Ⅰ型膠原可促進BMSCs向成骨細胞誘導分化。膠原有利于細胞黏附和早期血管的長入,并且可吸附血液中的生長因子。BMSCs具有來源廣泛、對機體的損傷小、分離方便、增殖快、能多向分化的優(yōu)點,已經(jīng)成為骨組織工程研究中的最佳種子細胞。本研究通過掃描電鏡和透射電鏡觀察SIS復合培養(yǎng)BMSCs,不同時期體內成骨的變化過程,發(fā)現(xiàn)應用SIS與BMSCs復合培養(yǎng)2周后,將細胞-材料復合體植入裸鼠皮下,在材料內形成大量的骨基質,并可見大量血管長入。成骨細胞總是毗鄰血管內皮細胞而存在,并隨著微血管的增生而逐漸向骨細胞發(fā)展,最后完全包埋于成熟骨基質中。而植入單純SIS材料的對照組,中心部位雖然也有血管生長,但始終無成骨細胞及成熟骨基質出現(xiàn),也未見成骨細胞與血管內皮細胞的毗鄰與依附關系,從超微結構上證實了SIS更有利于血管內皮細胞的生長,植入物的早期血管化促進了新骨形成。成骨細胞與血管內皮細胞的關系可能與VEGF介導有關。Kaigler等證明BMSCs在體外可分泌足量的VEGF而促近BMSCs的生長與分化,同時也發(fā)現(xiàn)BMSCs在體內可直接調節(jié)血管生成。VEGF可刺激血管內皮細胞的增殖與遷徙,并可增加血管的通透性,使許多血漿蛋白滲出血管外,這對改造局部的細胞外基質以適應血