牛海綿狀腦病

牛海綿狀腦病之實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)*導(dǎo)讀：BSE的診斷以組織病理學(xué)為主，并至少應(yīng)配合免疫組織化學(xué)染色法或西方免疫墨點(diǎn)法或酵素連結(jié)免疫吸附分析法等其中一種檢驗(yàn)方能進(jìn)行確診. 一、簡(jiǎn)介牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)，俗稱狂牛病(madcowdisease)，是一種引起牛致死性的傳染性神經(jīng)退行性疾病。1985年4月在英國(guó)首次觀察到牛有特殊的臨床癥狀，于1986年診斷出病原，其病原不是傳統(tǒng)的細(xì)菌或病毒等，但卻有感染力，稱之為變性普里昂蛋白質(zhì)(scrapieprionprotein,PrPsc)。目前認(rèn)為PrPsc會(huì)將神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)正常的PrPc轉(zhuǎn)化成PrPsc，而以等比級(jí)數(shù)的速度累積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，而造成神經(jīng)細(xì)胞死亡，終使腦組織變成海綿樣，所以是一種造成動(dòng)物致死性神經(jīng)變性的疾病，統(tǒng)稱為傳播性海綿狀腦病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSE)或普里昂疾病(priondiseases)，在人引起庫賈氏癥(Creutzfeldt-JakobDisease,CJD)、kuru癥、Gerstmann-Straussler-Scheinker癥候群(GSS)及致死性家族性失眠癥(fatalfamilialinsomnia,FFI)等，在牛引起B(yǎng)SE，在羊引起搔癢癥(scrapie)，在貂引起傳染性貂腦病(transmissibleminkencephalopathy,TME),在鹿與麋鹿引起慢性消耗病(chronicwastingdisease,CWD)，在貓、獅、豹引起貓科海綿狀腦病(felinespongiformencephalopathy,FSE),許多動(dòng)物皆有類似的疾病，在受感染宿主會(huì)形成腦組織的海綿狀變性與神經(jīng)膠細(xì)胞增生等病變。疾病之致病機(jī)序各有所不同，目前的研究顯示BSE的爆發(fā)可能是牛飼料添加之肉骨粉中含有大量的羊搔癢癥病原所致。此外，近年的研究顯示發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致BSE的病原與發(fā)生在人類的變異型庫賈氏癥(variantCJD)有關(guān)，所以將BSE的病原假定為會(huì)染給人類。自從英國(guó)爆發(fā)BSE之后，至2001年止許多國(guó)家包括：奧地利、比利時(shí)、捷克、丹麥、芬蘭、法國(guó)、德國(guó)、希臘、愛爾蘭、意大利、日本、列支敦斯登、盧森保、荷蘭、波蘭、葡萄牙、斯洛伐克、斯拉維尼亞、西班牙、瑞士等國(guó)也陸續(xù)有病例發(fā)生，尤其是2001年日本有三個(gè)確診病例，表示本病已由歐洲地區(qū)擴(kuò)散至亞洲地區(qū)，所幸國(guó)內(nèi)迄今未有病例報(bào)告。因此為了防范BSE入侵我國(guó)，確保國(guó)民健康及畜牧產(chǎn)業(yè)之永續(xù)發(fā)展，亟需建立國(guó)內(nèi)BSE診斷技術(shù)及診斷實(shí)驗(yàn)室，故筆者等于2001年7月28日至8月11日赴美國(guó)「國(guó)家普里昂疾病病理診斷中心」，2001年11月18日至23日接受國(guó)際畜疫會(huì)之邀請(qǐng)赴泰國(guó)參加「區(qū)域性牛海綿狀腦病診斷與監(jiān)測(cè)研習(xí)會(huì)」，研習(xí)BSE相關(guān)診斷技術(shù)，目前已符合國(guó)際畜疫會(huì)訂定之診斷標(biāo)準(zhǔn)，建立本病之實(shí)驗(yàn)室生物安全、組織病理學(xué)診斷、免疫組織化學(xué)染色法、西方免疫墨點(diǎn)法及酵素連結(jié)免疫吸附分析法等診斷流程并持續(xù)進(jìn)行本病之監(jiān)控計(jì)劃。二、現(xiàn)行診斷方法BSE的診斷以組織病理學(xué)為主，并至少應(yīng)配合免疫組織化學(xué)染色法或西方免疫墨點(diǎn)法或酵素連結(jié)免疫吸附分析法等其中一種檢驗(yàn)方能進(jìn)行確診，茲將已建立之實(shí)驗(yàn)室診斷方法詳述如后：組織病理學(xué)診斷法將采集的牛腦組織置于10%中性福爾馬林液固定完全后，取大腦、小腦及腦干共十個(gè)部位的腦組織，其重點(diǎn)部位為延腦(medullaoblongata)成〃V〃字形尖端的閂(obex)，修整為約4mm的厚度，放入脫水包埋盒中，再浸泡于98%的蟻酸中1小時(shí)(將具感染能力的prion不活化)，然后再浸泡于10%中性福爾馬林液中2天。再依一般例行之病理切片方法，將組織塊脫水、石蠟浸潤(rùn)、石蠟包埋等步驟，制作成3-5m厚之切片，脫蠟后以H&E染色及封片，于顯微鏡下觀察各部位腦組織切片中的病理變化。經(jīng)H&E染色之組織切片于顯微鏡下進(jìn)行判讀，感染BSE牛只在神經(jīng)病理學(xué)上主要呈三個(gè)特殊病變?yōu)椋?.腦皮質(zhì)灰質(zhì)部產(chǎn)生空洞狀退化。2.神經(jīng)元細(xì)胞壞死及數(shù)目減少。3.神經(jīng)星狀膠質(zhì)細(xì)胞增多(astrocytosis)，使腦組織呈現(xiàn)海綿樣變性(spongiformchange)□若發(fā)現(xiàn)上述病變者，則判定為陽性，但仍需進(jìn)行下列方法以進(jìn)行確診。免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry,IHC)利用對(duì)prion蛋白質(zhì)特異性的單株抗體及免疫染色技術(shù)來達(dá)到偵測(cè)牛腦組織中的PrPsc為目的。其組織切片制作方法與組織病理學(xué)診斷之步驟相同，每次染色需同時(shí)染陽性對(duì)照切片。組織切片如常規(guī)進(jìn)行脫蠟后，以磷酸鹽緩沖液(0.1Mphosphatebuffersolution,pH7.2,PBS)洗3次，置于蛋白？K溶液中37°C15分鐘。將切片放入不銹鋼盒中加入沸水，置于1bar121C高溫高壓滅菌器中20分鐘后，再以PBS洗3次，然后置于3%雙氧水溶液中10分鐘，再以PBS洗3次。取出切片，組織周圍以無塵拭紙吸干水分，置于保濕盤中，在組織上滴滿5%的正常豬血清，于室溫20分鐘，倒掉血清，在組織上滴滿PrP單株抗體(F99/97.6.1,VMRDInc.)，置于37C4小時(shí)或隔夜，再以PBS洗3次，在組織上滴滿次級(jí)抗體(biotinylatedsecondaryantibody,DAKOChemMatedetectionkits)，于室溫10分鐘，以PBS洗3次，在組織上滴滿受質(zhì)(peroxidaseconjugatedstreptavidin,DAKOChemMatedetectionkits)，置于室溫10分鐘，以PBS洗3次，再用蒸餾水洗去鹽類，在組織上滴滿呈色劑(AECorDABsubstrate,DAKOChemMatedetectionkits)于室溫5分鐘，用蒸餾水洗。滴上蘇木精復(fù)染數(shù)秒，然后水洗，滴上封片膠，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下鏡檢。西方免疫墨點(diǎn)法(Westernimmunoblotmethod)采用商品化檢測(cè)套組(PrionicsR-Check,RocheAppliedScience)，其原理主要是偵測(cè)腦組織中對(duì)蛋白？K有抵抗性的PrPsc，因?yàn)檎５膒rion蛋白質(zhì)會(huì)被蛋白？K所消化，而不正常的PrPsc對(duì)蛋白?K具有抗性，只會(huì)被部分消化，所以分子量會(huì)由32-35kD變?yōu)?7-30kD。選取延腦的閂(obex)或腦干或大腦灰質(zhì)部的腦組織，秤重后加入均質(zhì)液研磨成10倍均質(zhì)乳劑，取100l乳劑加10l消化緩沖液及10l蛋白？K混合均勻后置于50°C加熱40分鐘，然后加10l消化停止液以終止反應(yīng)。再加入100lPAGE樣本緩沖液混合均勻，加熱至96C5分鐘。架設(shè)電泳膠片，加入電泳緩沖液于電泳槽內(nèi)。將待測(cè)樣本及對(duì)照樣本各加10l于電泳膠片孔內(nèi)以200伏特電泳30-45分鐘。電泳膠片取出以濕式轉(zhuǎn)漬器來進(jìn)行轉(zhuǎn)漬(transfer)至PVDF膜上，于4C150伏特1小時(shí)。然后取出膜加入以PonceauS染色2分鐘，標(biāo)示標(biāo)記分子的大小，然后以TBST(Tris-Buffered-SalinewithTween)脫色。以PVDF阻斷緩沖液于室溫震蕩0.5-1小時(shí)，以1:5000倍稀釋的單株抗體，置于震蕩器上于室溫反應(yīng)1-2小時(shí)，然后以TBST洗4次，再以1:5000倍稀釋的次級(jí)抗體，置于震蕩器上于室溫反應(yīng)0.5-1小時(shí)，以TBST洗4次。將膜浸泡于Luminescence緩沖液中震蕩5分鐘，然后加入50lCDP-Star于室溫5分鐘，然后將膜上的水分吸干，置于透明保護(hù)膜內(nèi)于暗房中放入X光底片上壓片，再?zèng)_洗底片觀察結(jié)果。酵素連結(jié)免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)采用商品化檢測(cè)套組(BSEpurificationkit&PLATELIARBSEdetectionkit,Bio-Rad),此目前最快速且敏感的檢測(cè)方法，乳劑之制備方法同前，取5001乳劑加5001蛋白？K溶液(1mldenaturingsolution+4lproteinaseK)混合均勻，置于37°C10分鐘，再加500lclarifyingsolution，混合均勻后離心20000g5分鐘，倒掉離心管中的液體，并倒立于吸水紙上5分鐘，然后各加50lresolvingbuffer，置于100C加熱5分鐘，混合均勻后加入250lsamplediluent。取出檢測(cè)盤，于孔內(nèi)分別加入100l陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及待測(cè)樣品，用膠片封盤，置于37C感作75分鐘。以washingsolution清洗三次，拍干后加100lconjugate，再用膠片封盤，置于4C感作60分鐘，以washingsolution清洗五次，拍干后加100lrevelationsolution，置于室溫下之暗室30分鐘，加100lstoppingsolution，以450/620nm波長(zhǎng)ELISAreader讀取結(jié)果。三、其它診斷方法目前BSE的診斷除了前述的四種方法外，陸續(xù)可能還有許多更新的檢驗(yàn)技術(shù)與檢驗(yàn)套組會(huì)不斷地被開發(fā)出來，但目前大多仍處于研究階段未能普遍地被應(yīng)用于診斷。例如在檢驗(yàn)技術(shù)方面，有些實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基因轉(zhuǎn)殖鼠(transgenicmice)來進(jìn)行人工動(dòng)物接種試驗(yàn)，大幅縮短原先接種小白鼠所需的292天潛伏期，但因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)較費(fèi)人力，且需在符合生物安全三級(jí)的陰壓動(dòng)物舍飼養(yǎng)，所以目前仍只應(yīng)用于研究領(lǐng)域。另外在腦脊髓液的檢驗(yàn)方面，由BSE的確診病例發(fā)現(xiàn)，藉由雙向電泳分析法(twodimensionalgelelectrophoresis)可偵測(cè)出指標(biāo)性蛋白質(zhì)apolipoproteinE,但目前尚無法應(yīng)用于臨床診斷，因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)不具特異性，只可作為神經(jīng)退行性變化的非特異性指標(biāo)。同樣地，從腦脊髓液中偵測(cè)14-3-3蛋白質(zhì)的方法，或是藉由腦脊髓液與血清偵測(cè)S-100蛋白質(zhì)也因特異性低，同樣不適用于BSE的診斷。至于活體檢驗(yàn)部分，目前只有利用免疫組織化學(xué)染色法應(yīng)用于羊搔癢癥之扁桃腺與眼瞬膜進(jìn)行活體檢驗(yàn)，但是根據(jù)實(shí)驗(yàn)接種牛的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不僅在潛伏期，甚至在臨床發(fā)病期都無法從淋巴組織偵測(cè)到具有感染力的prion，故不能應(yīng)用于BSE的診斷，所以目前仍有許多學(xué)者正在積極地研發(fā)其它活體生前的檢驗(yàn)方法。亦有學(xué)者藉由電子化學(xué)分析法(electrochemicalanalysis)偵測(cè)感染prion動(dòng)物尿液中的代謝物，但是這種方法的敏感性和特異性較低，目前仍不建議用作單一的診斷法。在檢驗(yàn)套組方面，目前除了前述商品化的免疫西方