熒光光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

熒光光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

一、基本原理

1、熒光的產(chǎn)生2、熒光的壽命：10-8―10-4s3、磷光的壽命：10-4―102s4、紫外的壽命：10-15s

紫外觀察不到的過程，其它兩種光譜可以觀察到，如生色團(tuán)及其環(huán)境的變化。5、由于它是發(fā)射光譜，所以靈敏度很高。6、磷光

二、儀器結(jié)構(gòu)與主要光譜參量1、儀器結(jié)構(gòu)2、主要光譜參量（1）吸收譜、熒光激發(fā)光譜、及熒光發(fā)射光譜

N-甲基咔唑在環(huán)己烷（2）熒光壽命去掉激發(fā)光后，分子的熒光強(qiáng)度(I0)將到1/e

I0所需要的時(shí)間，用表示，=1/k。如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，熒光壽命稱為F,它與kF（熒光發(fā)射速率常數(shù)）成反比，F(xiàn)可以給出有關(guān)分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)方面的信息。（3）量子產(chǎn)率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率，用表示。發(fā)射熒光分子在全部退激分子中所占比例。（4）熒光強(qiáng)度

F(I)=kP0C三、影響熒光的因素1、熒光與化合物的結(jié)構(gòu)（1）躍遷類型*能發(fā)出較強(qiáng)的熒光，所以*是產(chǎn)生熒光的主要類型，主要是由于？。（2）共軛效應(yīng)增大熒光物質(zhì)的，從而使更多分子處于激發(fā)態(tài)，有利于熒光的發(fā)射。（3）剛性結(jié)構(gòu)與共平面效應(yīng)（4）取代基效應(yīng)給電子基團(tuán)如：-OH,-NH2,-OCH3,通過p-共軛，增強(qiáng)熒光.

吸電子基團(tuán)如：-NO2,-COOH,降低熒光.（5）溶劑的影響

極性增加，發(fā)生紅移。（1-氨基-8-萘磺酸酯），從辛醇乙二醇，紅移且強(qiáng)度降低。（6）熒光淬滅因素

a.碰撞淬滅

b.能量轉(zhuǎn)移

c.氧的淬滅作用

d.自淬滅

e.光照四、熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光

主要來自Trp,Tyr,Phe,相對強(qiáng)度比為100:9:0.5.對于含有Trp,蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)Trp的特征,最大發(fā)射在320-350nm之間.如果只有Tyr和Phe,蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)Tyr的特征,最大發(fā)射波長在304nm之間.應(yīng)用:反應(yīng)計(jì)量比的測定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.Ca2+對phospho-calsequestrin蛋白的影響

熒光增強(qiáng)且藍(lán)移表明:Trp的微環(huán)境從極性表面轉(zhuǎn)移到疏水內(nèi)部.Appl.Phys.2000,B71,755-7633.Zn2+對氨基?；傅挠绊?

熒光降低且紅移,Trp從疏水內(nèi)部向外部移動(dòng).4.外源熒光的應(yīng)用5、共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量（FRET）轉(zhuǎn)移及應(yīng)用輻射能量轉(zhuǎn)移

熒光分子發(fā)射的熒光為某一物質(zhì)分子吸收，前者（能量給予體,D）的熒光減弱或猝滅，后者（能量接受體,A）被激發(fā)：

D*D+ｈνA+ｈνA*

非輻射能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)作用機(jī)理的不同，非輻射能量轉(zhuǎn)移分為共振能量轉(zhuǎn)移和交換能量轉(zhuǎn)移.

共振能量轉(zhuǎn)移即熒光共振能量轉(zhuǎn)移，機(jī)理是通過分子的偶極－偶極耦合作用進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，分子間有一定的距離。能量傳遞距離甚至可達(dá)7.0——10.0nm,也稱為長距離能量轉(zhuǎn)移.給予體和接受體的共振能量轉(zhuǎn)移能級圖能量轉(zhuǎn)移效率

RO又叫Fr?ster半徑（單位?），在給予體和接受體分子間的距離等于RO時(shí)，能量轉(zhuǎn)移和給予體的衰變幾率相等.FDA為受體存在時(shí)供體的熒光強(qiáng)度;FD供體單獨(dú)存在時(shí)的熒光強(qiáng)度RO值的計(jì)算

A1/2表示當(dāng)有50％的能量轉(zhuǎn)移效率（即激發(fā)態(tài)給予體的50％由熒光共振能量轉(zhuǎn)移去活化）.熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基本條件給予體和接受體分子必須靠近（一般是1-10nm），即在遠(yuǎn)大于碰撞半徑（r）的距離上發(fā)生。接受體的吸收光譜必須與給予體的熒光發(fā)射光譜重疊。給予體和接受體分子的偶極轉(zhuǎn)移空間定向必須近似平行。能量轉(zhuǎn)移效率與介質(zhì)的粘度變化無關(guān)。最可能的熒光共振能量轉(zhuǎn)移是單重態(tài)-單重態(tài)和三重態(tài)-單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移過程給予體和接受體對給予體接受體Ro(?)熒光素四甲基羅丹明55IAEDANS1熒光素46EDANS2DABCYL333熒光素?zé)晒馑?4BODIPYFL4BODIPYFL57BODIPYFL四甲基羅丹明

四甲基羅丹明CY5531-氯蒽苝411-氯蒽紅熒烯381-氰蒽紅熒烯84菲熒光素35*三苯胺葉綠素54*N,N-二甲胺9-甲蒽24**三重態(tài)-單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移；1.5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸;四甲基羅丹明碘乙酰胺菁染料Cy5

5-((((2-IODOACETYL)AMINO)ETHYL)AMINO)

NAPHTHALENE-1-SULFONICACID,IAEDANS

5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸

Msx(Msx-homeodomain)Themsxhomeodomainproteinisadownstreamtranscriptionfactorofthebonemorphogeneticprotein(BMP)-4signalandakeyregulatorforneuraltissuedifferentiation.

接受體分子是,標(biāo)記蛋白質(zhì)中6，10，27位置的半胱氨酸；給予5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸（IAEDANS）體是蛋白質(zhì)分子中48位置的色氨酸（Trp-48）,能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在AEDANS和Trp-48之間，據(jù)此計(jì)算在蛋白質(zhì)中6，10，27位置到48位置的距離分別約是1.9，2.3和1.6nm.研究α型和突變體π型胞漿

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別

通過用1-苯胺基－8－萘磺酸（ANS）為接受體標(biāo)記胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的非催化位點(diǎn)，以胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶中的催化位點(diǎn)色氨酸（Trp）殘基為給予體，利用FRET研究人類α型和突變體π型胞漿谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)，α型中給予體-接受體間距離2.2nm,π型中距離1.82nm。