電化學(xué)生物傳感器的研究與應(yīng)用

電化學(xué)生物傳感器的研究與應(yīng)用

0在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用生物傳感器一詞被廣泛用于描述生命系統(tǒng)或相關(guān)生物源的設(shè)備。其完整的概念可以認(rèn)為是由作為識別元件的固定化的生物敏感材料(包括酶、抗體、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)),以及作為物理換能器的適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)換器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等)所組成的體系。當(dāng)待測物質(zhì)與分子識別元件發(fā)生特異性的結(jié)合后,所產(chǎn)生的復(fù)合物信號(如光、熱、電等)通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成光、電等可輸出信號,從而達(dá)到對待測物質(zhì)進(jìn)行分析檢測的目的。從識別元件來看,蛋白質(zhì)(主要包括酶、抗體)相比其他材料而言,具有功能的多樣性、對特定底物識別的專一性,以及分子本身的可操控性等不可比擬的優(yōu)點,因此成為目前最為常用的識別元件。而從信號轉(zhuǎn)換來看,電化學(xué)技術(shù)由于具備靈敏、快速、成本低廉、檢測裝置輕便、低能耗且易于微型化和集成化等優(yōu)點,已成為生物傳感器領(lǐng)域最為活躍的檢測手段。進(jìn)入21世紀(jì),隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,納米材料在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物傳輸、基因治療等多個領(lǐng)域顯示了巨大的優(yōu)勢。對于生物傳感領(lǐng)域而言,納米材料在光學(xué)性能、電學(xué)性能、磁學(xué)性能、力學(xué)性能和化學(xué)活性等方面表現(xiàn)出的獨特性能使其成為很好的換能器元件;另一方面,生物傳感器中的分子運作本身就是基于納米層次,納米材料的參與可以將其優(yōu)良的性能很好地整合到分子運作中,從而改進(jìn)甚至革新分子運作的體系。鑒于以上特點,納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用引起了越來越多科研工作者的興趣。本文從納米材料的角度綜述了近年來基于蛋白質(zhì)與納米材料發(fā)展新型電化學(xué)生物傳感器方面的研究進(jìn)展。1基于納米金的傳感器金屬納米材料良好的電子傳遞性能使其成為電化學(xué)生物傳感器中最為常用的納米材料之一,其中尤以納米金的應(yīng)用最為廣泛。納米金制備簡單、性狀穩(wěn)定、生物相容性良好,而且易于進(jìn)行表面化學(xué)修飾,因此,利用納米金與生物分子進(jìn)行組裝并介導(dǎo)電子傳遞,是構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的良好方案。Willner課題組于2003年在Science上發(fā)表文章介紹了納米金的經(jīng)典應(yīng)用。他們將葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GOD)的輔基FAD修飾到納米金表面,再通過雙巰基化合物的連接將FAD修飾的納米金固定到金電極上。當(dāng)引入脫輔基的GOD后,由于FAD與酶的特異結(jié)合,完整的GOD可以最大限度地保持其原有結(jié)構(gòu)和活性而組裝到電極表面,從而催化葡萄糖的氧化。通過監(jiān)測催化過程中FAD經(jīng)納米金介導(dǎo)傳遞到電極表面的電化學(xué)信號,可以對底物葡萄糖進(jìn)行定量分析。此后他們又利用納米金與聚陰離子組成的“微桿”介導(dǎo)得到了溶液中GOD的電化學(xué)響應(yīng),從而實現(xiàn)葡萄糖的高靈敏檢測(圖1)。結(jié)果顯示,納米金的使用一方面使得GOD與電極間的電子傳遞速率提高了25倍,另一方面,“微桿”結(jié)構(gòu)所提供的巨大的比表面積使得即使在溶液狀態(tài)下也能獲得GOD的電化學(xué)信號(圖2)。近年來,基于納米金與GOD所構(gòu)建的各種葡萄糖生物傳感器層出不窮,并發(fā)展出了一系列優(yōu)秀的實驗設(shè)計方案。比如,Sun等發(fā)展了GOD在納米金表面的共價固定以及基于層層組裝技術(shù)(layer-by-layer,LBL)的多層設(shè)計,Ju等發(fā)展了摻入GOD和納米金顆粒的碳糊電極,Chen等發(fā)展了殼聚糖和納米金的聯(lián)合運用,還有許多實驗方案不在此一一列舉[9~16]。除了基于GOD的葡萄糖傳感器外,在基于辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)的H2O2傳感器[17~28]、基于次黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XOD)的次黃嘌呤/黃嘌呤傳感器[29~31]、基于乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)的乙醇傳感器、基于乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的乳酸傳感器、基于乙酰膽堿酯酶的含磷殺蟲劑傳感器、基于膽固醇氧化酶的膽固醇傳感器,以及基于酪氨酸酶的酚類傳感器等設(shè)計中,納米金的應(yīng)用同樣取得了很好的效果。此外,生理條件下并不作為酶的一些氧化還原蛋白,比如血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、肌紅蛋白(myoglobin,Mb)以及細(xì)胞色素c(cytochromec,cytc),經(jīng)過與納米金在電極表面共修飾組裝后也可表現(xiàn)出一定的酶活性,因而可用于構(gòu)建檢測H2O2、NO等底物的生物傳感器[39~45]。納米金的另一個主要應(yīng)用是參與構(gòu)建基于抗原-抗體識別的電化學(xué)免疫傳感器。圖3顯示的是一個典型的納米金參與的免疫傳感器的示意圖。相比經(jīng)典的酶聯(lián)免疫傳感器———ELISA,納米金更為穩(wěn)定,在復(fù)雜的檢測環(huán)境不易降解和變性。更重要的是,通過與其他納米材料聯(lián)用,可以實現(xiàn)多靶標(biāo)的檢測。基于納米金的這些優(yōu)良特性,近年來,涌現(xiàn)出眾多基于納米金的免疫傳感器[46~64]。比如,蔣健暉等以人免疫球蛋白G(hIgG)為模型分析物,使固定化抗體與分析目標(biāo)物hIgG及納米金標(biāo)記的hIgG抗體結(jié)合于電極表面,通過金沉積使電極表面的納米金顆粒直徑增大,并通過金增強表面吸附伏安分析實現(xiàn)了hIgG的高靈敏定量免疫檢測。袁若等通過LBL組裝將多層辣根過氧化物酶/納米金及L-半胱氨酸等材料組裝到電極表面,實現(xiàn)對甲胎蛋白抗體的固定,研制出用于檢測甲胎蛋白抗原(alpha-fetoprotein,AFP)的免疫傳感器。信號標(biāo)記對于免疫傳感器而言是煩瑣的一步,Yu等使用納米金發(fā)展了無標(biāo)記的IgE檢測,并有望成為通用的免疫傳感設(shè)計。綜合來看,納米金用于構(gòu)建以蛋白質(zhì)為識別元件的電化學(xué)生物傳感器主要具備以下幾個優(yōu)勢:1)作為金屬材料,納米金是電子的良導(dǎo)體,可以最大限度地促進(jìn)電子傳遞,從而實現(xiàn)低電位下的電分析,以避免高電位中的噪音和干擾。2)作為納米材料,其大的比表面積十分有利于蛋白質(zhì)以及電化學(xué)信號探針等分子在電極表面的大量固定,從而有效地提高信號強度并實現(xiàn)信號放大。3)納米金具有良好的生物相容性,即使進(jìn)行在體實驗也未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞有明顯的毒副作用;在分子層面,這種良好的生物相容性還可為蛋白質(zhì)提供良好的微環(huán)境,從而保持蛋白質(zhì)的生物活性。4)納米金可以很方便的通過靜電作用或共價作用進(jìn)行表面的化學(xué)修飾,從而為多樣化的蛋白質(zhì)表面固定方案打下基礎(chǔ)。納米銀和納米鉑是另外兩種在電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建中較為常用的金屬納米材料[68~75]。由于與納米金的性質(zhì)相似,基于這兩種納米材料的傳感器設(shè)計與基于納米金的傳感器設(shè)計有異曲同工之妙,在此不一一贅述。2swnts上的組裝自從1991年首次被報道以來,碳納米管(carbonnanotubes,CNTs)可以說是被研究得最多的納米材料。對其理化性質(zhì)的深入了解,以及對其功能的不斷開拓,為其在生物傳感器構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。與納米金一樣,CNTs同樣也具備極好的電子傳遞能力、蛋白質(zhì)的高負(fù)載能力以及良好的生物相容性,而且,由于CNTs本身的物質(zhì)基礎(chǔ)就是碳,因此其功能化將更為方便和多樣。此外,由于CNTs為一維納米材料,意味著CNTs在電極表面的組裝將呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀,因此,非常有利于蛋白質(zhì)的固定。Davis等精細(xì)地描繪了GOD在單壁碳納米管(single-wallednanotubes,SWNTs)上的組裝(圖4)。他們通過氧化SWNTs,使之表面帶上充裕的活性基團(tuán),一方面有助于SWNTs在溶液中的分散,另一方面也給GOD的組裝提供了便利條件。結(jié)果顯示,即使不加入EDC、NHS等共價連接的活化劑,GOD也能在SWNTs表面很強地吸附并保持活性。他們將此吸附有GOD的SWNTS組裝到玻碳電極上,得到了良好的GOD響應(yīng),其信號強度是沒有SWNTs參與時的10倍,顯示出SWCNTs在酶負(fù)載和能量轉(zhuǎn)換上都具有良好的效果。除了在電極表面的平鋪組裝外,CNTs還可以通過化學(xué)氣相沉積(chemicalvapordeposition,CVD)直接在電極表面垂直生長。Fang等運用這種方法在電極表面生長CNTs,并利用(4-羧苯基)重氮鹽在CNTs表面的電化學(xué)還原對CNTs進(jìn)行了功能化,從而共價連接Hb,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hb具有良好的電化學(xué)響應(yīng),并可用于構(gòu)建H2O2傳感器(圖5)。Wisitsoraat等也利用這種方法在金覆蓋的SiO2/Si基底上生長了CNTs,然后通過電化學(xué)聚合在CNTs表面固定聚苯胺(polyaniline,PANI)和膽固醇氧化酶,利用循環(huán)伏安法對底物膽固醇進(jìn)行了檢測,取得了良好的結(jié)果。目前,基于以上兩種方式,利用CNTs構(gòu)建酶傳感器[79~97]和免疫傳感器[98~106]的報道數(shù)量眾多,在此不一一列舉。需要提出的是,由于CNTs難以具備納米金那樣良好的形態(tài)分布,因此對有序的表面組裝提出了挑戰(zhàn)。另外,大多數(shù)蛋白質(zhì)的尺寸都屬于零維的納米級,因此在一維的CNTs表面組裝相對而言缺少靈活性。出于這些考慮,將CNTs與零維的納米顆粒,如納米金、納米鉑等聯(lián)合運用,在一定程度上可以克服兩者在某些方面的缺陷,因而也是傳感器構(gòu)建中的良好策略[107~113]。3催化劑fe3o4和tio3除了具備納米材料共有的一些性質(zhì)外,納米氧化物還依材料的不同具備一些特殊的效應(yīng),比如納米Fe3O4的磁效應(yīng)、納米TiO2的光電效應(yīng)等。而這些效應(yīng)在新型生物傳感器的構(gòu)建中可以產(chǎn)生一些意想不到的效果。在這一部分,我們將著重就納米氧化物特殊效應(yīng)的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和回顧。磁性納米顆?，F(xiàn)在已被廣泛用于分離富集、靶向運輸?shù)确矫娴难芯?但在生物傳感領(lǐng)域,磁效應(yīng)的應(yīng)用還不廣泛。Willner等利用納米Fe3O4首次實現(xiàn)了電化學(xué)催化的磁控制,如圖6所示,他們首先合成了能夠穩(wěn)定分散于有機溶劑中的磁性納米Fe3O4,并構(gòu)建了一個雙層的電解液,上層為有機溶劑甲苯,下層為水溶液。當(dāng)磁場處于上方時,Fe3O4分散在甲苯中,下方的GOD可以催化葡萄糖的氧化并得到電信號;但當(dāng)磁場轉(zhuǎn)移到電極下方,Fe3O4將被吸引下來覆蓋住電極表面,從而阻礙GOD與電極的電子傳遞,失去了電驅(qū)動的GOD便無法進(jìn)行催化,由此,通過轉(zhuǎn)換磁場方向即可非常方便地控制酶催化反應(yīng)進(jìn)程。納米TiO2是另一種具有特殊效應(yīng)(光電效應(yīng))的納米材料,由于具有極強的紫外線屏蔽能力和很高的表面活性,納米TiO2已經(jīng)被大量用于污水處理、消毒殺菌,以及在化妝品和涂料中防紫外線侵蝕。作者所在實驗室曾利用納米TiO2這種特有的性質(zhì)構(gòu)建了高靈敏的H2O2傳感器(圖7)。一般來講,蛋白質(zhì)在紫外線照射下很容易變性,但是我們利用納米TiO2與Hb共修飾后發(fā)現(xiàn),一定時間的紫外線照射后,Hb不僅沒有失活,其催化活性反而大大提高,電化學(xué)檢測H2O2的靈敏度提高了3倍,檢測限降低了兩個數(shù)量級。這一方面得益于TiO2對紫外線的屏蔽保護(hù)了Hb,另一方面,TiO2在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)活性物質(zhì)促進(jìn)了Hb催化性能的提高。作者所在實驗室在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)納米ZnO也具有類似的效用。4在電化學(xué)檢測量子點作為熒光標(biāo)記物,已經(jīng)被廣泛用于熒光示蹤。在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域,量子點同樣有著特殊的用途。以金屬硫/硒/碲化物(Zn/Cd/Pb-S/Se/Te)等為代表的量子點,一方面是很好的生物標(biāo)記材料,另一方面,其中的金屬離子Zn2+、Cd2+、Pb2+可用于陽極溶出伏安法檢測,從而提供電化學(xué)信號。Wang等利用三種量子點(ZnS、CdS以及PbS)分別標(biāo)記三種抗體,并利用磁性納米顆粒進(jìn)行分離富集,通過溶出伏安法檢測Zn2+、Cd2+、Pb2+在不同電位下的峰電流,可以同時檢測三種抗原的存在(圖8)。其他一些課題組也利用量子點的這種性質(zhì)進(jìn)行了一些傳感設(shè)計[118~120]?？偟膩碚f,基于量子點的電化學(xué)傳感設(shè)計具有以下一些優(yōu)點:1)由于近年來量子點相關(guān)技術(shù)的日趨成熟,用于電化學(xué)檢測的量子點的制備以及功能化比較方便,有商品化的產(chǎn)品可供選擇;2)不同的量子點可以提供不同的電化學(xué)信號,這為多組分的分析提供了條件;3)溶出伏安法是基于金屬離子的氧化還原分析,其理論檢測限可達(dá)到飛摩爾水平,這為痕量檢測打下了基礎(chǔ)。5納米顆粒的組裝不同的納米材料各自具備一定的特性,在電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計中使用單一的材料難以充分發(fā)揮納米材料的性能,因此,同時使用多種納米材料成為一個解決方案。一種思路是首先合成兩種或多種納米材料,然后在傳感器的構(gòu)建中同時或在不同階段分別運用,比如圖6所介紹的量子點與磁性納米顆粒的運用;另一種思路則是在納米材料的合成階段將不同的材料進(jìn)行組裝,即合成復(fù)合納米材料,將不同納米材料的特性整合到一個納米復(fù)合體中。一個很好的例子是CNTs與金屬納米顆粒復(fù)合的材料,另一個例子則是合成核/殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒,而且這種做法目前更為常見。Yu等合成了MgFe2O4@SiO2核/殼納米顆粒,由SiO2外殼提供良好的酪氨酸酶組裝界面,由磁性的MgFe2O4內(nèi)核實現(xiàn)蛋白在電極表面的磁控富集。由此構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感體系可以對酶底物苯酚實現(xiàn)良好的檢測。這種核/殼納米顆粒一方面保持了磁性納米顆粒的磁效應(yīng),另一方面又為蛋白質(zhì)提供了良好的組裝界面和微環(huán)境,因而成功地綜合了兩種納米材料的優(yōu)良特性。Zhu等則充分利用AgCl和PANI的特性合成了AgCl@PANI納米顆粒,一方面AgCl外殼克服了PANI在水相中難以分散的缺點,并為后續(xù)的電化學(xué)信號獲取提供了良好的電子傳遞界面,另一方面,PANI為傳感器在堿性條件下的使用提供了條件,并有效地防止了抗壞血酸的氧化,他們利用此復(fù)合納米材料構(gòu)建了用于檢測多巴胺的電化學(xué)生物傳感器。此外,Calvo、Zeng等課題組[123~127]也開展了一系列基于核/殼納米顆粒的傳感器研究工作。6新技術(shù)帶來的挑戰(zhàn)納米科技與電化學(xué)技術(shù)的結(jié)合和相互滲透