elisa方法常見錯誤結(jié)果的分析

elisa方法常見錯誤結(jié)果的分析

elisa方法廣泛應(yīng)用于各種抗劑和抗劑試驗。但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在臨床檢驗中如果處理不當(dāng),會出現(xiàn)一些錯誤結(jié)果(即假陽性或假陰性結(jié)果)。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有:①標(biāo)本因素;②操作因素;③試劑因素。本文主要就標(biāo)本因素和操作因素對ELISA測定的影響做如下討論。1血清相同標(biāo)本血清是最常用的ELISA標(biāo)本,血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本。標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致,分為內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)兩種。1.1檢測結(jié)果影響因素有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。1.1.1fc段直接結(jié)合的問題人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合,從而導(dǎo)致假陽性。解決該情況的辦法是:①用F(ab)2替代完整的IgG;②標(biāo)本用偶聯(lián)有熱變性(63℃,10min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效);③檢測抗原時,可用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中,使RF降解。1.1.2假陽性的解決方法它能夠與固相一抗,標(biāo)記二抗Fe結(jié)合或影響它們的結(jié)合而造成假陽性。解決的辦法是:①用EDTA稀釋標(biāo)本;②用56℃,30min加熱血清使C1q滅活。1.1.3elisa比的篩選人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig(s)結(jié)合的天然嗜異性抗體,可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來,也能造成假陽性。解決的辦法是:可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig(s),但加入量不足或亞類不同時無效。1.1.4elisa方法干擾抗體測定抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體,有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn),測定前需用理化方法將其解離后再測定。1.1.5抗鼠抗體和ig抗體(s)抗體臨床采用鼠源性CD3等單克隆抗體治療,用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù),均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體;另外,被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig(s)抗體,ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是:測定抗原時,在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig(s),從而克服由于上述原因造成的假陽性。1.1.6交叉抗體對測定抗原的影響類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等,是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大,但在用單克隆抗體測定抗原時,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應(yīng)的靶決定簇時,也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。1.1.7樣品中其他成分的影響血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等,均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。1.2血標(biāo)本的采集、貯存、采集等外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過久、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。1.2.1紅細(xì)胞損害作用溶血的原因有許多,主要有體外溶血和體內(nèi)溶血兩種。體外溶血可由物理因素(如機械性破壞、冰凍)、化學(xué)因素(如血樣接觸表面活性劑)和代謝性因素(如遺傳病引起的血細(xì)胞脆性增加)引起。體內(nèi)溶血可由物理因素(人工心臟瓣膜或大血管手術(shù)后)、生物因素(如惡性瘧疾)和藥物毒性反應(yīng)等因素引起。由于各種標(biāo)本溶血,均可因紅細(xì)胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白,在洗滌過程中往往難以完全洗脫,它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧[O],從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì),在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中,會導(dǎo)致非特異性顯色,干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用,標(biāo)本采集時必須注意避免溶血。1.2.2樣品受到細(xì)菌污染因菌體中可能含有內(nèi)源性過氧化物酶,因此,被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣,亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。1.2.3elisa測定血清標(biāo)本的過程在冰箱中保存過久的標(biāo)本,血清中IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深,甚至造成假陽性。標(biāo)本放置時間過長(如一天以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾,ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集。如不能立即測定,5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4℃,1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存。凍存后融解的標(biāo)本,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混合后再測定,但混勻時應(yīng)輕柔,不可強烈振蕩。1.2.4elisa檢測血液中離心分離的情況在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下,正常血液采集后1/2～2h開始凝固,18～24h完全凝固。臨床檢驗工作中,有時為了爭取時間快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結(jié)果。這類情況于次日復(fù)查時因血凝已完全,血清中不再有纖維蛋白存在,故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用,解決的辦法最好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。1.2.5elisa測定干擾因素抗凝劑(如肝素)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。綜上所述,對臨床檢驗ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果,在考慮試劑因素和操作因素之外,更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析,并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用,從而為臨床提供正確可靠的檢測結(jié)果。2操作因素2.1教育的影響溫育是影響ELISA測定結(jié)果的關(guān)鍵因素。溫育時間不夠,弱陽性標(biāo)本檢測不出;溫育溫度不夠,弱陽性標(biāo)本也難以檢出。2.2洗板次數(shù)的確定洗板對ELISA測定來說也是關(guān)鍵步驟。洗板分手工洗板和機器洗板,一般認(rèn)為機器洗板較手工洗板效果要好,關(guān)鍵是洗板次數(shù)的選擇。洗板次數(shù)較少,造成殘留,可引起假陽性結(jié)果;洗板次數(shù)過多,可造成抗原抗體結(jié)合物洗脫,造成假陰性結(jié)果。2.3驗室操作人員不嚴(yán)格按說明書操作影響顯色的關(guān)鍵是顯色溫度和顯色時間,有些實驗室操作人員不嚴(yán)格按說明書操作,因為擔(dān)心“花板”,往往是顯色時間不到就匆忙終止顯色,結(jié)果造成弱陽性標(biāo)本不能顯色而導(dǎo)致假陰性發(fā)生。2.4elisa檢測法的應(yīng)用加入樣品、試劑及混勻時間的差異稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在,尤為手工操作更著,對結(jié)果都會產(chǎn)生或大或小的影響。ELISA常用項目,例如:乙肝兩對半,多是成批檢測。從加第一個樣本到最后一個樣本,包括中間換吸管尖的工作,在這一過程中有一個時間差,加試劑及混勻也同樣存在時間差,這種操作時間差會致使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間的不一致,而這種不一致可以直接導(dǎo)