目的基因的克隆-PCR法擴增目的基因片斷課件

目的基因的克隆—

PCR法擴增目的基因片斷PCR(PolymeraseChainReaction)，聚合酶鏈式反應,模擬了發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制的過程目的基因的克隆—

PCR法擴增目的基因片斷PC1DNA的結構（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脫氧核糖核苷dNTP三磷酸雙脫氧核糖核苷ddNTPDNA的結構（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脫氧核糖核苷dN2DNA的結構（2）A腺嘌呤G鳥嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶

五種堿基A-TC-GDNA的結構（2）A腺嘌呤五種堿基A-TC-G3DNA的結構（3）氫鍵維持了DNA的雙螺旋結構DNA的結構（3）氫鍵維持了DNA的雙螺旋結構4DNA的復制（1）3’-OH進攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’DNA的復制（1）3’-OH進攻5’-Pi5DNA的復制（2）DNA復制相關蛋白在復制起始點打開雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結合到單鏈DNA上進一步解開雙鏈DNADNA的復制（2）DNA復制相關蛋白6DNA的復制（3）DNA的復制（3）7DNA的復制和體外的模擬模板（母鏈）細胞內(nèi)源外源加入打開雙鏈解鏈酶加熱變性維持單鏈單鏈結合蛋白高溫引物引物合成酶外源加入底物dNTP細胞內(nèi)源外源加入聚合酶細胞內(nèi)源外源加入反應環(huán)境細胞內(nèi)環(huán)境緩沖液DNA的復制和體外的模擬模板（母鏈）細胞8PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性9PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性10PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性11PCR循環(huán)—退火PCR循環(huán)—退火12PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸13PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸14PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸15PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸16PCR整個過程PCR整個過程17討論1：為何酶促反應需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其是第一次反應的模板防止非特異性的引物退火延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度

DNA聚合酶不能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶

常規(guī)用的PCRDNA聚合酶是從一種嗜熱細菌分離出來的DNA聚合酶。酶活性在1000C條件下，能保持幾個小時。而其最適合酶促溫度在720C左右。

討論1：為何酶促反應需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其18討論2：影響PCR質(zhì)量的一些因素模板:選用純度較高的DNA作模板，雜質(zhì)蛋白和RNA的存在都會影響到DNA聚合酶與引物和模板的結合。目的片斷：目的片斷或者目的片斷相鄰的DNA含GC量較高，或者有重復序列存在，都會導致二級結構的存在?？稍诜磻w系里加入DMSO，破壞模板的二級結構。引物的設計：引物太短，要求退火的溫度就低，錯配的可能性就大，再者，兩條引物不能存在較長的互補片斷。酶：純度、可信度，堿基錯配率<1/10000。討論2：影響PCR質(zhì)量的一些因素模板:選用純度較高的DNA作19討論3：PCR的應用從藍藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人體內(nèi)細胞中自由基抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰食品、保健品、藥品、化妝品基因庫檢索

SOD的序列

設計引物

以藍藻總DNA位模板做PCR獲得的基因片斷連接在表達載體原核表達蛋白討論3：PCR的應用從藍藻里面克隆SOD清除人體內(nèi)細胞中自由20討論3：PCR的應用檢測粉末樣品是否含有炭疽桿菌

炭疽菌恐慌，降臨美國，席卷全球生命力強、傳染快、發(fā)作快、死亡率高。有兩對引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌EF因子的基因序列設計的，僅與各種炭疽桿菌的EF因子同源。PCR產(chǎn)物是1247bp和208bp的片斷。非炭疽桿菌均呈陰性。用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2小時取培養(yǎng)液直接作PCR討論3：PCR的應用檢測粉末樣品是否含炭疽菌恐慌，降臨美國，21討論3：PCR的應用基因測序基因組計劃首要任務就是測序Sanger雙脫氧法ddATP-綠色熒光ddTTP-紅色熒光ddCTP-藍色熒光ddGTP-橙色熒光討論3：PCR的應用基因測序基因組計劃首要任務就是測序ddA22討論3：PCR的應用基因測序討論3：PCR的應用基因測序23實驗步驟：1.取一個干凈PCR專用小管2.往PCR管里面加入各種試劑3.設定好機器各種參數(shù)4.開始PCR5.電泳檢測PCR結果無菌去離子水34ul10XPCR緩沖液5uldNTP混合液4ulMg++溶液3ul引物1