太湖藍(lán)藻水華期間微囊藻種群豐度研究

太湖藍(lán)藻水華期間微囊藻種群豐度研究

1實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)微囊藻是湖泊富營養(yǎng)化湖泊形成水華最常見的優(yōu)勢種群之一，在許多微囊藻中可以產(chǎn)生微囊藻毒素（sivonintal.，1999）。研究表明，在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，有毒微囊藻和非保護(hù)區(qū)藻類的豐度隨時(shí)間的推移而變化。兩種資源的豐度及其比例關(guān)系具有空間變化的特點(diǎn)（湯加爾納爾.2003；rinta-kanta-2005；yoshida等人研究了mikata湖泊中的毒微囊藻和非毒微囊藻的豐度。結(jié)果表明，當(dāng)沉積物微囊藻和沉積物微囊藻的豐度隨時(shí)間的推移而變化時(shí)，沉積物微囊藻的豐度為0.5%-35%（yoshidatal.，2007）。沉積物微囊藻的豐度直接決定了沉積物微囊藻的毒性，是評估藍(lán)藻水華生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)之一。一般來說，湖泊中的綠藻水華通常有幾種微藻。不同類型微藻是否具有特定的細(xì)菌特征。同一物種的產(chǎn)毒率也與微囊藻的大小有關(guān)（chenetal.2009；simarketal.2004）。這為用傳統(tǒng)的微觀察法研究湖泊中的毒微囊藻和非毒微囊藻物種帶來了許多困難。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻水華研究（rina-kantotal.，2005；dy藻體al.，2008；schoberetal.，2007）。根據(jù)特定的設(shè)計(jì)指南，可以量化藍(lán)藻水華樣品中的綠藻、微藻和微藻。與顯微的觀點(diǎn)相比，qpcr具有高度靈活動性和連續(xù)性的優(yōu)勢（zhangetal.2006）。同時(shí)，它不受樣品形狀的限制，而是在水和土壤樣本中研究目標(biāo)生物。太湖是我國第三大淡水湖泊,面積2338km2,平均水深1.89m,是個(gè)典型的淺水湖泊.太湖位于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的長江三角洲地區(qū),是該區(qū)域工農(nóng)業(yè)用水的主要水源地,同時(shí)具有養(yǎng)殖、航運(yùn)和旅游功能.隨著太湖富營養(yǎng)化水平加重,夏季藍(lán)藻水華發(fā)生已成常態(tài)化.微囊藻是太湖藍(lán)藻水華的優(yōu)勢種群,其生物量可占藻類總生物量90%以上(Chenetal.,2003).基于顯微觀察法和色素定量法對太湖水體和底泥中微囊藻種群分布已有研究(Songetal.,2007;Jietal.,2009).施麗梅等利用QPCR技術(shù)研究了梅梁灣水體中產(chǎn)毒微囊藻種群豐度隨時(shí)間變化的規(guī)律(施麗梅等,2009).本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分別以微囊藻毒素合成基因mcyA和藻藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(PC-IGS)為研究對象,對太湖藍(lán)藻水華期間不同湖區(qū)微囊藻種群豐度及其組成進(jìn)行研究,以揭示湖泊富營養(yǎng)化水平對產(chǎn)毒微囊藻與非產(chǎn)毒微囊藻種群分布的影響.2材料和方法表面活性劑2.1樣品采集和處理根據(jù)太湖富營養(yǎng)化程度和夏季藍(lán)藻分布規(guī)律,結(jié)合課題需要,我們共設(shè)置了4個(gè)采樣點(diǎn)(圖1).梅梁灣(N2)、竺山灣(N5)、貢湖灣(N4)和湖心(S4).梅梁灣和竺山灣屬于重富營養(yǎng)化湖區(qū),貢湖灣和湖心屬于中度富營養(yǎng)化湖區(qū).2009年8月中旬微囊藻水華期間采集樣品,為了保證采樣點(diǎn)準(zhǔn)確性,采用GPS定位系統(tǒng).用2.5m長的PVC管采集整水柱,均勻混合.同時(shí)用多功能水質(zhì)參數(shù)儀(YSI6600-V2,YellowSpringInstruments,USA)原位測定水體理化參數(shù),包括溶解氧、電導(dǎo)率、濁度、水溫、pH等.柱狀采泥樣器同步采集表層底泥(0～3cm).每個(gè)采樣點(diǎn)采集6個(gè)樣品,混合均勻,置于4℃黑暗保存.所有樣品均在4h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理.2.2總氮和總磷GF/C玻璃纖維濾膜過濾50mL水樣,濾液用Skalar自動分析系統(tǒng)測定水體中氨態(tài)氮(NH+4-N)、硝態(tài)氮(NO-3-N)、亞硝態(tài)氮(NO-2-N)和正磷酸鹽(PO3?443--P).總氮(包含水體中的藻類)、總磷(包含水體中的藻類)和泥樣總氮、總磷按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定(金相燦和屠清瑛,1990).2.3底泥中基因組dna的提取用GF/C濾膜過濾100mL水樣(根據(jù)生物量大小調(diào)整水樣體積),濾膜置于-20℃保存.濾膜基因組DNA提取按照Rinta-Kanto的方法進(jìn)行(Rinta-Kantoetal.,2005),主要步驟如下:用滅菌剪刀將濾膜剪碎,放入2mL滅菌離心管中,加入600μL裂解液(40mmol·L-1EDTA,400mmol·L-1NaCl,50mmol·L-1Tris-hydrochloride,pH9.0),加入溶菌酶至終濃度為2mg·mL-1,37℃水浴30min,每隔10min輕輕顛倒離心管數(shù)次,取出離心管加入蛋白酶K(100μg·mL-1)和SDS(2%),50℃水浴2～3h,每隔30min顛倒離心管數(shù)次.水浴后取出離心管冷卻至室溫,加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,體積比)抽提,13000r·min-1離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中,加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1,體積比),抽提2次,12000r·min-1離心15min,轉(zhuǎn)移水相到新滅菌離心管中,加入2倍體積4℃預(yù)冷無水乙醇和0.1倍體積10mol·L-1醋酸銨溶液,-20℃放置過夜.13000r·min-1離心15min沉淀DNA,小心傾掉上清液,用70%乙醇洗滌2次,室溫自然晾干,加入100μL滅菌超純水溶解DNA.-20℃保存?zhèn)溆?先將泥樣凍干,稱取1.0g泥樣提取底泥中基因組DNA,提取方法參照申慧彥的方法進(jìn)行(申慧彥等,2004),基因組DNA溶于200μLTris-HCl-EDTA(TE,pH8.0)中,取出150μL,利用Mobio公司純化試劑盒(Mobio-12877)進(jìn)行純化,該過程能夠有效去除各種PCR抑制劑(腐殖質(zhì)、有機(jī)酸等).純化后基因組進(jìn)行QPCR分析.2.4pc-igs基因擴(kuò)增利用室內(nèi)培養(yǎng)的產(chǎn)毒微囊藻Microcystisaeruginosa7806構(gòu)建定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,該藻種由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)提供.培養(yǎng)基為BG-11,培養(yǎng)溫度為25℃,光照強(qiáng)度為40μmol·m-2·s-1,光照周期為12h/12h.離心收集處于對數(shù)生長期的藻細(xì)胞,按照文獻(xiàn)方法(Rinta-Kantoetal.,2005)提取基因組DNA,用BioPhotometerPlus(Effendorf)測定DNA濃度和純度(ABS260/ABS280),該藻株基因組大小為5.2MB,單個(gè)堿基的平均摩爾分子量是660g·mol-1,標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度中含有目的基因的拷貝數(shù)可以用下面的公式計(jì)算(Vaitomaaetal.,2003):標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度(copies·mL-1)=6×1023(copies·mol-1)×DNA濃度(g·mL-1)/基因組分子量(g·mol-1).設(shè)置6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度(10倍梯度稀釋),每個(gè)濃度3個(gè)平行.引物188F(5′-GCTACTTCGACCGCGCC-3′)與254R(5′-TCCTACGGTTTAATTGAGACTAGCC-3′)特異性擴(kuò)增微囊藻微囊藻藻藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(PC-IGS)用于總微囊藻種群定量化研究(KurmayerandKutzenberger.,2003),引物M1r-F(5′-AGCGGTAGTCATTGCATCGG-3′)和M1r-R(5′-GCCCTTTTTCTGAAGTCGCC-3′)特異性擴(kuò)增產(chǎn)毒微囊藻微囊藻mcyA基因,用于產(chǎn)毒微囊藻定量化研究(Yoshidaetal.,2007).QPCR反應(yīng)體系25μL,其中含有12.5μL2×SYBRpremixExTaqTM混合液(TaKaRa),1pmol引物,2μL模板,超純水補(bǔ)足25μL.PCR反應(yīng)在replex4(Eppendorf)熒光定量PCR儀上完成.PC-IGS基因擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性2min,95℃變性20s,56℃退火30s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán).McyA基因擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性2min,95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,40個(gè)循環(huán).最后進(jìn)行溶解曲線(meltingcurve)分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果Mastercycleepreplex軟件分析.定量PCR擴(kuò)增效率e(Amplificationefficiency)=10-1/s-1,S代表標(biāo)準(zhǔn)曲斜率.2.5數(shù)據(jù)處理和分析用MicrosoftExcel2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.3結(jié)果結(jié)果3.1營養(yǎng)鹽和總氮采樣時(shí)間在上午8:00至11:00之間進(jìn)行,風(fēng)速在3.0m·s-1上下.采樣點(diǎn)營養(yǎng)鹽濃度如表1所示.可以看出,竺山灣(N5)和梅梁灣(N2)營養(yǎng)鹽水平顯著高于湖心(S4)和貢湖灣(N4),尤其是總磷和正磷酸鹽濃度.采樣期間平均水溫為30.5℃,DO為6.70～7.13mg·L-1,pH值為7.87～8.40,電導(dǎo)率為0.20～0.47mS·cm-1,濁度為10.4～90.0NTU.底泥中梅梁灣(N2)和竺山灣(N5)總氮和總磷濃度高于貢湖灣和湖心.3.2pcr擴(kuò)增效率實(shí)驗(yàn)McyA和PC-IGS基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,循環(huán)閾值Ct(thresholdcycle)和DNA濃度對數(shù)值(log10D,D為基因組拷貝數(shù))之間呈線性關(guān)系.PC-IGS定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.36X+39.54(R2=0.99,p<0.01),斜率S為-3.36,擴(kuò)增效率e為0.98.mcyA基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.50X+37.36(R2=0.99,P<0.01),曲線斜率S為-3.50,擴(kuò)增效率e為0.93.其中Y表示定量PCR反應(yīng)循環(huán)閾值,X表示基因組拷貝數(shù)對數(shù)值.溶解曲線分析顯示(數(shù)據(jù)未給出),定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為目的產(chǎn)物,而非引物二聚體.說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠性.3.3種類型種群豐度根據(jù)QPCR結(jié)果可以得出(圖3),水華期間湖區(qū)間微囊藻種群豐度及其組成差異明顯,富營養(yǎng)化嚴(yán)重的梅梁灣和竺山灣,產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度比貢湖灣和湖心要高,其中竺山灣產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度分別為8.28×106和2.01×107copies·mL-1,湖心區(qū)產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度最低,分別為4.08×104和4.36×105copies·mL-1,種群豐度相差達(dá)2個(gè)數(shù)量級.湖區(qū)間產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻的比例也不同,竺山灣和梅梁灣該比值較高,分別為41.21%和40.25%,貢湖灣為28.53%,湖心最低,為9.36%.3.4底泥中微囊藻種豐度及其組成從圖4可以看出,在太湖藍(lán)藻水華發(fā)生期間,表層底泥中微囊藻種群豐度仍然較高.其中梅梁灣產(chǎn)毒微囊藻與總微囊藻種群豐度最高,分別為2.89×105和3.41×106copies·g-1(dryweight).湖心產(chǎn)毒微囊藻與總微囊藻種群最低,分別為3.83×103和1.52×105copies·g-1(dryweight).與水體相比,底泥中產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群比例較低.梅梁灣、竺山灣、貢湖灣和湖心該比值分別為8.49%、6.51%、5.14%和2.22%.可以看出,底泥中微囊藻種群豐度及其組成與水體微囊藻種群豐度及其組成沒有直接關(guān)系.4水體富營養(yǎng)水平與產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度的關(guān)系熒光定量PCR技術(shù)在藍(lán)藻水華研究中應(yīng)用已相當(dāng)廣泛.利用微囊藻毒素合成基因家族成員為研究對象,對水華期間產(chǎn)毒微囊藻種群進(jìn)行定量化研究,能夠快速確定藍(lán)藻水華毒性,對藍(lán)藻水華的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)做出評價(jià)(Baxaetal.,2010).建立目標(biāo)DNA片段定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線是應(yīng)用定量PCR技術(shù)分析野外樣品中目標(biāo)生物種群豐度的基礎(chǔ),擴(kuò)增效率e是評價(jià)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要指標(biāo)之一.在實(shí)際應(yīng)用中,定量PCR擴(kuò)增效率在0.80～1.15之間才能滿足實(shí)驗(yàn)要求(Zhangetal.,2006).在本實(shí)驗(yàn)中,分別構(gòu)建了微囊藻毒素合成基因mcyA和藻藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)PC-IGS序列的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于定量化研究產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度.mcyA和PC-IGS序列定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率分別為0.93和0.98,滿足了定量PCR實(shí)驗(yàn)的要求.為了減少底泥樣基因組樣品中PCR反應(yīng)抑制劑對定量PCR造成的影響,對泥樣基因組進(jìn)行了純化,雖然增加了實(shí)驗(yàn)成本,但是保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性.本研究應(yīng)用QPCR技術(shù)對太湖藍(lán)藻水華期間產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度進(jìn)行研究.結(jié)果表明,不同湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻與總微囊藻種群豐度及其比例關(guān)系差異顯著:處于超富營養(yǎng)化狀態(tài)的梅梁灣和竺山灣,產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度顯著高于貢湖灣和湖心,產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻比例分別為41.21%和40.25%,貢湖灣和湖心產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例相對較低,分別為28.53%和9.36%,具有明顯的空間差異性.這說明水體的富營養(yǎng)水平對產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度分布具有重要影響,營養(yǎng)鹽濃度高的湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度高于低營養(yǎng)鹽湖區(qū),產(chǎn)毒微囊藻所占總微囊藻種群的比例也較高.在對其它一些湖泊研究中,發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象.Rinta-Kanto等研究了伊利湖(Erie)水華期間藍(lán)藻、微囊藻和產(chǎn)毒微囊藻種群豐度分布特征及其與環(huán)境因子關(guān)系,發(fā)現(xiàn)隨TP濃度增加,總微囊藻種群豐度和產(chǎn)毒微囊藻種群豐度都隨之增加,產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例波動范圍從6.5%到59.5%(Rinta-Kantoetal.,2009).Yoshida等調(diào)查了日本Mikata湖產(chǎn)毒微囊藻與總微囊藻種群豐度隨季節(jié)變化特征,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比值范圍為0.5%到35%,該比值與硝態(tài)氮(NO-3-N)濃度呈顯著正相關(guān),而與正磷酸鹽(PO3?443--P)濃度和水溫?zé)o關(guān)(Yoshidaetal.,2007).Davis等通過N、P添加實(shí)驗(yàn)證明,隨N、P濃度增加,產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻種群生長速率率增加,微囊藻種群豐度也隨之提高,產(chǎn)毒微囊藻生長速率高于非產(chǎn)毒微囊藻,產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例也提高(Davisetal.,2009).當(dāng)然,除營養(yǎng)鹽水平外,其它一些環(huán)境因子,比如溫度、光照等都能對產(chǎn)毒微囊藻種群豐度及其占總微囊藻種群比例產(chǎn)生影響(Davisetal.,2009;Kardinaaletal.,2007).同時(shí),生物間相互作用也能對微囊藻種群起調(diào)控作用,Yoshida等從水體中分離到一種感染產(chǎn)毒微囊藻的噬菌體,隨微囊藻水華發(fā)展階段其種群豐度也隨之變化,對產(chǎn)毒微囊藻種群起到控制作用(Yoshidaetal.,2006).因此,營養(yǎng)鹽濃度是決定產(chǎn)毒微囊藻種群和非產(chǎn)毒微囊藻種群豐度分布的因子之一.底泥是微囊藻重要的分布場所,隨季節(jié)的變化,其種群豐度變化很大.對于淺水湖泊而言,底泥中微囊藻種群生物量波動更大,這可能和淺水湖泊更有利于微囊藻復(fù)蘇(Brunbergetal.,2003).對底泥中微囊藻種群動態(tài)的研究,重點(diǎn)集中在藍(lán)藻復(fù)蘇過程及底泥藍(lán)藻復(fù)蘇對水柱中藍(lán)藻生物量的貢獻(xiàn),而對藍(lán)藻水華暴發(fā)期間底泥微囊藻種群動態(tài)變化及其影響因子研究較少.吳曉東等研究了太湖藍(lán)藻越冬和復(fù)蘇過程,發(fā)現(xiàn)底泥藍(lán)藻復(fù)蘇過程中生物量逐漸增加(3～5月份),然后迅速下降(吳曉東等,2008).張曉峰等研究發(fā)現(xiàn)太湖底泥藍(lán)藻復(fù)蘇一般從3月份開始,6月份結(jié)束,底泥表面微囊藻復(fù)蘇進(jìn)入水體,藍(lán)藻上浮量占浮游藻類最大生物量的