細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告細胞生物學(xué)實驗報告第2頁第3頁細胞生物學(xué)實驗報告第1頁細胞生物學(xué)實驗報告小鼠脾細胞原代培養(yǎng)姓名：杜旭學(xué)號：201100230155系年級：2011級臨七一班同組者：趙偉日期：2012/4/25【實驗?zāi)康摹竣睂W(xué)習(xí)并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。⒉了解原代細胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。⒊學(xué)習(xí)細胞計數(shù)及營養(yǎng)液的配制?！緦嶒炘怼竣奔毎囵B(yǎng)原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。⒉細胞死活鑒定死活細胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異。染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機理的不同，染料或使死細胞著色，或使活細胞著色?！袼阑罴毎谏頇C能和性質(zhì)上的差異主要包括：☆死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍，又稱錐藍，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細胞膜。所以經(jīng)臺盼藍染色后只能使死細胞著色，而活細胞不被著色。甲基藍有類似的染色機理。植物細胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活?！钏阑罴毎诖x上的差異：是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據(jù)。美藍是一種無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍染色后活的酵母細胞無色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態(tài)，從而被染成藍色或淡藍色。除此之外，還有一些細胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質(zhì)和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細胞中，細胞核和細胞質(zhì)被染成紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍-中性紅混合染色法?！緦嶒炗闷贰竣辈牧闲“资螈苍噭┡_盼藍、伊紅、PBS緩沖液、細胞培養(yǎng)液（含生長因子）⒊器材剪子、棉球、75%酒精、移液槍、無菌操作臺、正置光學(xué)顯微鏡、倒置光學(xué)顯微鏡、解剖盤、滴管、離心管、離心機、注射器、Eppendorf管、培養(yǎng)皿、酒精燈、塑料培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、血細胞計數(shù)板【實驗步驟】⒈取材取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。⒉分離脾細胞用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用“L”型針頭輕輕刮出脾細胞。在均勻吹勻脾臟細胞。吸取上述分離的單個脾細胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。⒊培養(yǎng)脾細胞取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⒋配制染液用生理鹽水配成5%臺盼藍染液，備用。⒌染色取0.5mL細胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液?；旌稀?-5min后將細胞放在血細胞計數(shù)板上觀察死活情況，注意不要有氣泡產(chǎn)生，放大倍數(shù)為10x10。染色后活細胞不著色，死細胞顯示藍色。注意染色時間不能超過15min，否則染液將細胞毒殺。⒍計數(shù)在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算血細胞計數(shù)板的4個4小方格的細胞數(shù)量。包括細胞總數(shù)與死細胞數(shù)量。壓線者計上不計下，計左不計右。⒎計算細胞活力根據(jù)公式：細胞活力=(總細胞數(shù)-死細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%【實驗結(jié)果】臺盼藍染色后的細胞（10x10）伊紅染色后的細胞（10x10）總細胞數(shù)和活細胞數(shù)統(tǒng)計表（10×10）項目總細胞數(shù)﹙個/ml﹚活細胞數(shù)﹙個/ml﹚細胞活力自己培養(yǎng)細胞1.4×1063.0×10521.4%老師培養(yǎng)細胞7.5×1055.5×10573.3%【分析與討論】⒈結(jié)果分析本次實驗中我們小組自己培養(yǎng)細胞所測細胞活力為21.4%，并不算高，分析得應(yīng)有以下原因可能影響實驗結(jié)果（包括誤差）：⑴若在無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會極大的影響觀察，導(dǎo)致實驗失敗。⑵若在離心分離呈單細胞的過程中離心機轉(zhuǎn)速過快或時間過長很可能會導(dǎo)致細胞破裂，導(dǎo)致小鼠脾細胞大量死亡。⑶染色時間過長，或觀察時間過長都會導(dǎo)致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降，這是導(dǎo)致細胞活力比較低的重要原因。⑷實驗中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計算帶來的誤差等也會直接導(dǎo)致實驗誤差。⒉注意事項⑴嚴格進行動物消毒，需用75%酒精消毒。⑵嚴格進行無