酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)教案

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)（一）——堿性磷酸酶Km值的測(cè)定【目的要求】1.了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2.了解米氏方程、Km值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求Km的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1、堿性磷酸酶：堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多其次為腎臟，骨骼、腸、和胎盤等組織。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。本實(shí)驗(yàn)用的堿性磷酸酶是從大腸桿菌中提取。2、米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系，導(dǎo)出了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基本公式，即：QUOTE(1)式中：v表示酶促反應(yīng)速度，QUOTE表示酶促反應(yīng)最大速度，[S]表示底物濃度，QUOTE表示米氏常數(shù)。3、QUOTE值的測(cè)定主要采用圖解法，有以下四種：①雙曲線作圖法（圖1-1，a）根據(jù)公式（1），以v對(duì)[s]作圖，此時(shí)1/2QUOTE時(shí)的底物濃度[s]值即為Km值，以克分子濃度（M）表示。這種方法實(shí)際上很少采用，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條件下的底物濃度很難使酶達(dá)到飽和。實(shí)測(cè)QUOTE一個(gè)近似值，因而1/2QUOTE不精確。此外由于v對(duì)[S]的關(guān)系呈雙曲線，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要求較多，且不易繪制。②Lineweaver-Burk作圖法雙倒數(shù)作圖法（圖1-1，b）實(shí)際工作中，常將米氏方程（式（1））作數(shù)學(xué)變換，使之成為直線行駛，測(cè)定要方便、精確地多。其中之一即?。?）式的倒數(shù)，變換為L(zhǎng)ineweaver-Burk方程式：QUOTE(2)以QUOTE對(duì)QUOTE作圖，即為y=ax+b形式。此時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE。把直線外推與橫軸相交，其截距相交，其截距即為—QUOTE。③Hofstee作圖法（略）把（2）式等號(hào)兩邊乘以QUOTE，得：QUOTE(3)以v對(duì)QUOTE作圖，這時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE，橫截距為QUOTE。④Hanas作圖法（略）把（2）式等號(hào)兩邊乘以[S],得：QUOTE(4)以v對(duì)QUOTE作圖，這時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE。（a）(b)本實(shí)驗(yàn)主要以雙倒數(shù)法，即Lineweaver-Burk作圖法來測(cè)定堿性磷酸酶Km值。具體原理如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，在適宜條件下（PH10.0，和60℃），準(zhǔn)確反應(yīng)13分鐘。在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍(lán)色化合物，以波長(zhǎng)620nm比色。在一定條件下色澤深淺與光密度成正比。反應(yīng)式如下：然后以光密度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度，即以光密度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法來測(cè)定堿性磷酸酶Km值?！緝x器與試劑】?jī)x器：恒溫水浴721型分光光度計(jì)試劑：酚試劑：稱鎢酸鈉（QUOTEWQUOTE·2QUOTEO）100g，鉬酸鈉（QUOTEMoQUOTE·2QUOTEO）25g置1500mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000mL，過濾即成，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時(shí)用蒸餾水稀釋一倍，最后酸度為1N。2.5mM磷酸苯二鈉基質(zhì)液：稱取625g磷酸苯二鈉（C6H5PO4Na2?2H2O），用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解，并稀釋至1,000ml，加數(shù)滴氯仿防腐，貯于棕色瓶?jī)?nèi)，置冰箱內(nèi)保存，可用一周。堿性緩沖液（pH10.0）：稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1,000ml.堿性磷酸酶液：稱取堿性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱內(nèi)可保存五周左右?！緦?shí)驗(yàn)步驟】取6支試管按下表加入試劑：1234562.5mM磷酸苯二鈉（ml）0.20.40.60.81.01.0蒸餾水（ml）0.80.60.40.2-0.1堿性緩沖液（ml）1.01.01.01.01.01.0混勻后，60℃欲溫5分鐘堿性磷酸酶液（ml）0.10.10.10.10.1-混勻后，60℃水浴13分鐘（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）注意：1）加入堿性磷酸酶液要快速、準(zhǔn)確。用“槍”加2）此時(shí)為酶促反應(yīng)，總體積2.1ml3）第六管不加酶，無反應(yīng)。酚試劑（ml）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(ml)3.03.03.03.03.03.0混勻后，37℃水浴15分鐘注意：1）酚試劑為顯色劑，同時(shí)為酶的變性劑，故加入酚試劑后酶促反應(yīng)即停止。2）Na2CO3提供堿性環(huán)境，加入Na2CO3后試劑才顯色，37℃水浴使顯色充分以6管為調(diào)零點(diǎn)，在620nm波長(zhǎng)處比色?！窘Y(jié)果處理】1將各管光密度和底物濃度記入下表管號(hào)O.D1/O.D[S]1/[S]123452以1/O.D為縱坐標(biāo)，1/[s]為橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖，求出堿性磷酸酶的Km值?！咀⒁馐马?xiàng)】1）加入堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確2）保溫時(shí)間要準(zhǔn)確提供方法：如從第一管加入酶液開始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘向下一只試管加酶液,直至加完，到準(zhǔn)確13分鐘立即向第一管加酚試劑，以終止其反應(yīng)，并每隔1分鐘向下一只試管加酚試劑,直至加完止，這樣保證每管準(zhǔn)確保溫13分鐘?！舅伎碱}】（待定）1）Km的意義2）為什么酶促反應(yīng)速度以初速度表示3）為什么O.D可直接代替V作圖4）分析自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)（二）——溫度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鉁囟葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會(huì)全部或部分的恢復(fù)其活性。【儀器與試劑】?jī)x器：1．冰箱2.恒溫水浴鍋3.試管和試管架4．吸量管及吸量管架5.移液槍及槍頭6.膠頭滴管7．燒杯試劑：1．PH6.8的緩沖液：量取15.45ml的0.2M磷酸氫二鈉和4.55ml的檸檬酸混合搖勻即可。2．0.5%淀粉的0.5%氯化鈉溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化鈉，溶于100ml蒸餾水（需加熱）。3．0．03175g/L碘液4．1MHCl溶液5.1MNaOH溶液6.稀釋100倍的唾液【實(shí)驗(yàn)步驟】1．制管和預(yù)溫實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，并不是將下表三種試劑直接混合加入同一試管，而是每個(gè)溫度梯度使用兩支試管，分別標(biāo)記為A管和B管。A管加入PH6.8的緩沖液和0.5%淀粉液；B管使用移液槍加入稀釋100倍的唾液，相對(duì)應(yīng)的兩支試管置于設(shè)定的溫度下預(yù)溫5min。取12支潔凈試管，參照下表加入試劑：管號(hào)1（0℃）2（室溫）3（37℃）4（50℃）5（70℃）6（室溫）APH6.8的緩沖液（ml）222222含NaCl的0.5%淀粉液（ml）22222用2ml的蒸餾水代替B稀釋100倍的唾液（ml）111111*6號(hào)管為對(duì)照組（比色時(shí)作為0號(hào)管），置于室溫，且淀粉液用蒸餾水代替2．混合A、B管將一號(hào)A管試劑迅速加入溫度對(duì)應(yīng)的B管中(為了最大限度保證酶的量)，此時(shí)為計(jì)時(shí)的起點(diǎn)（使用秒表），搖勻后放回對(duì)應(yīng)溫度繼續(xù)水浴。這一步應(yīng)注意：轉(zhuǎn)移A管試劑前需將其搖勻。3．時(shí)間控制然后每隔1min或2min（時(shí)間自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6號(hào)的A、B管混合，控制好時(shí)間。4．中止反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)13min，向1號(hào)管加入2滴1MHCl溶液，立即混勻，中止反應(yīng)，按上一步的順序和時(shí)間間隔依次對(duì)各管進(jìn)行操作，并移至試管架。后再各用2滴1MNaOH溶液中和每管。5．顯色在每管中各加入2ml0.03175g/L碘液并混勻，觀察現(xiàn)象。6．比色若不同溫度梯度間現(xiàn)象差別不明顯，則進(jìn)行比色，通過光密度值來比較?！窘Y(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），做出合理分析?！咀⒁馐马?xiàng)】【思考題】實(shí)驗(yàn)（三）——PH對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私釶H對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】【儀器與試劑】?jī)x器：1、冰箱2、電爐3、恒溫水浴鍋4、試管架及試管5、移液管架及移液管試劑：1、0.2M磷酸氫二鈉溶液：稱取35.61g含2個(gè)結(jié)晶水的磷酸氫二鈉，用水定容至1L。2、0.1M檸檬酸溶液：稱取21.01g含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：將唾液分別稀釋10倍、50倍和100倍，得三種不同濃度的酶液、4、0.5%淀粉的0.5%氯化鈉溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化鈉，溶于100ml蒸餾水（需加熱）。5、0.1%淀粉液：0.1g可溶性淀粉，加到100ml蒸餾水中，加熱溶解。6、碘液：15g碘化鉀和12.7g碘，加少許水使碘完全溶解后，再用水稀釋至200ml。7、1%氯化鈉溶液。8、0.1%硫酸銅溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】（一）PH對(duì)酶活性的影響1、緩沖溶液的配制表23-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制取六只潔凈的三角燒瓶，按表23-1編號(hào)和加試劑：三角燒瓶號(hào)123456PH值5.46.26.87.07.48.00.2M磷酸二氫鈉（ml）11.1513.2215.4516.4718.1719.450.1M檸檬酸（ml）8.856.784.553.531.830.55取六支潔凈試管，編號(hào)后按表23-2操作：表23-2pH對(duì)酶活性的影響管號(hào)123456PH值5.46.26.87.07.48.0緩沖液量（ml）333333含Nacl的0.5%淀粉（ml）222222稀釋100倍唾液（ml）222222充分搖勻，37℃水浴保溫，嚴(yán)格控制時(shí)間5min后，立即向各管加入碘液碘液（滴）333333充分搖勻，觀察各管顏色差異【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），做出合理分析?！咀⒁馐马?xiàng)】【思考題】實(shí)驗(yàn)（四）——酶濃度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饷笣舛葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】在適宜的條件下，若反應(yīng)物濃度大大高于酶濃度時(shí)，反應(yīng)速度隨酶濃度增加而增加，兩者間成正比。本實(shí)驗(yàn)采用唾液淀粉酶為例。加入不同濃度的酶，并比較在同一適當(dāng)時(shí)間后，以碘檢驗(yàn)淀粉的含量從而確認(rèn)其反應(yīng)程度?！緝x器與試劑】?jī)x器：恒溫水浴鍋吸量管試管與試管架試劑：含NaCI的0.5%淀粉液pH7.0的緩沖液分別稀釋過10、50和100后的唾液【實(shí)驗(yàn)步驟】1.取3支潔凈試管，按下表加入淀粉液，緩沖液，加畢后放入37度恒溫水浴中保溫5分鐘；2.保溫后，快速加入不同濃度的稀釋唾液，搖勻，立即放入37度恒溫水浴中，并計(jì)時(shí)。約3至4分鐘后加入稀釋后等量的碘液一至兩滴，立即搖勻后，記錄各管的顏色。管號(hào)含NaCI的0.5%淀粉液/mLpH7.0的緩沖液/mL稀釋唾液/mL顏色10倍50倍100倍132123213321【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象，做出合理分析?！咀⒁馐马?xiàng)】【思考題】實(shí)驗(yàn)（五）——離子對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私怆x子對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】酶的活性常常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱為酶的激活劑；有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱為酶的抑制劑。Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。其它的陰離子，如Br-、NO3-和I-對(duì)該酶也有激活作用，但較微弱。而Cu2+對(duì)唾液淀粉酶具有抑制作用。激活劑和抑制劑影響酶活性的劑量是很少的，并且常具有特異性。就本實(shí)驗(yàn)，低濃度CI-可以增加酶活性，高濃度的CI-或者低濃度的Cu2+則會(huì)抑制酶活性，同時(shí)低濃度的Na+、SO42-等對(duì)酶活性沒有影響。激活劑的作用機(jī)制是多種多樣的，可能是作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分，也可以直接作為酶活性中心的構(gòu)成部分?！緝x器與試劑】?jī)x器