傳染病實(shí)習(xí)報(bào)告

PAGEPAGE１４實(shí)習(xí)報(bào)告一、實(shí)習(xí)目的1、通過對(duì)雛雞接種未知的細(xì)菌和病毒，待雞發(fā)病后進(jìn)行病理剖檢和細(xì)菌病毒的分離，掌握臨床診斷、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)相結(jié)合，同時(shí)掌握對(duì)一般傳染病進(jìn)行診斷，確定感染的細(xì)菌和病毒種類；2、掌握傳染病基本臨床診斷過程和實(shí)驗(yàn)室診斷的基本策略和方法。二、實(shí)習(xí)安排與流程（一）實(shí)習(xí)安排時(shí)間地點(diǎn)內(nèi)容2012年5月28日逸夫樓4017安排實(shí)習(xí)內(nèi)容；分組；配制各種試劑和培養(yǎng)基；剖解雛雞，觀察臟器病理變化，并用病變臟器做組織觸片；采集病變臟器；接種細(xì)菌至平板上分離培養(yǎng)；病料研磨勻漿，凍融。2012年5月29日逸夫樓4017細(xì)菌的染色鏡檢；細(xì)菌的純培養(yǎng)；細(xì)菌的增殖培養(yǎng)；10%雞紅細(xì)胞制備；雞胚接種。2012年5月30日逸夫樓4017藥敏試驗(yàn)；生化試驗(yàn)；照蛋，觀察雞胚存活情況。2012年5月31日江浦農(nóng)場(chǎng)；逸夫樓4017參觀江浦農(nóng)場(chǎng)；照蛋，觀察雞胚存活情況；觀察生化試驗(yàn)結(jié)果；觀察藥敏試驗(yàn)結(jié)果。2012年6月1日逸夫樓4017提取尿囊液；瓊擴(kuò)試驗(yàn)；血凝試驗(yàn)。2012年6月2日逸夫樓4017觀察瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；觀察血凝試驗(yàn)結(jié)果。2012年6月3日逸夫樓4017總結(jié)實(shí)習(xí)結(jié)果，撰寫實(shí)習(xí)報(bào)告（二）實(shí)習(xí)流程：平板劃線分離、肉湯接種平板劃線分離、肉湯接種純培養(yǎng)生化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)器材，配制試劑藥敏試驗(yàn)觀察動(dòng)物發(fā)病情況檢測(cè)細(xì)菌檢測(cè)病毒病料勻漿反復(fù)凍融接種雞胚取尿囊液雞胚接種血凝與血凝抑制三、實(shí)習(xí)內(nèi)容上周五（5月25日）：準(zhǔn)備試驗(yàn)、接種病毒、照蛋等。上周日（5月27日）：接種細(xì)菌周一（5月28日）1、配制試劑：（1）生理鹽水：NaCl8.5g，加去離子水至1000ml，121℃高壓15min滅菌備用。（2）PBS緩沖液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g，加去離子水至1000ml，121℃高壓15min滅菌備用。（3）LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、瓊脂15g，加去離子水至1000ml，121℃高壓15min滅菌備用。（4）氯化鎂孔雀綠增菌液：取商品化粉末50g，1%瓊脂粉，加去離子水1000ml，加熱溶解，121℃高壓15min滅菌備用。（5）亞硒酸鹽胱氨酸增菌液：亞硒酸鹽胱氨酸粉23g，1%瓊脂粉，加去離子水1000ml，混合加熱至56℃，每個(gè)試管分裝3ml，水浴加熱至沸騰，再煮3～5min，冷藏備用。（6）伊紅美蘭瓊脂：取商品化粉末42g，加去離子水1000ml，按1%比例加入瓊脂粉，溶解后121℃高壓15min滅菌備用。待冷至50℃時(shí)，按20～25ml/塊傾注無菌平板，靜置至凝固，倒置備用。平板內(nèi)培養(yǎng)基充分凝固吼，置溫箱內(nèi)烘干表面水分。（7）麥康凱瓊脂平板：取商品化粉末53g，加去離子水1000ml，按1%比例加入瓊脂粉，溶解后121℃高壓15min滅菌備用。待冷至50℃時(shí)，按20～25ml/塊傾注無菌平板，靜置至凝固，倒置備用。平板內(nèi)培養(yǎng)基充分凝固吼，置溫箱內(nèi)烘干表面水分。（8）SS瓊脂：取商品化粉末62g，加去離子水1000ml，按1%比例加入瓊脂粉，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至50℃左右，搖勻，按20～25ml/塊傾注無菌平板，靜置至凝固，倒置備用。（9）瓊脂：8%NaCl24g，PBS300ml，瓊脂粉4.03g（10）3.8%枸櫞酸鈉溶液：取3.8g的商品化粉末，加100ml水，溶解后121℃高壓15min滅菌備用。2、雛雞臨床癥狀觀察：體溫升高，拉稀，糞便成白色糊狀，有尿酸鹽沉積，羽毛粗亂，腹部羽毛被糞便污染，呆立不動(dòng)，精神萎靡，眼閉不睜，喜歡打堆，呼吸較急促。3、剖檢：人工發(fā)病雞編號(hào)為1、2，進(jìn)行解剖，觀察各個(gè)組織臟器的肉眼病變，做好記錄，同時(shí)用部分組織器官做觸片經(jīng)染色確定組織器官中是否有細(xì)菌存在。(1)剪斷病雞的頸靜脈處死，然后在大腿與腹壁之間各剪一剪，將大腿向兩側(cè)用力壓，直至股骨頭露出，使其平衡仰臥放置。在腹壁劃開皮膚，將其向兩邊掀開，注意肌肉有無出血或壞死。沿腹壁至胸側(cè)兩邊向前剪斷肋骨，然后用力將胸骨向頭部掀開，暴露胸腹腔，觀察肝、脾、心及心包、肺、腎等器官的病變。結(jié)果：肝臟稍有腫大，其他器官無明顯病變。(2)用火焰消毒過的剪刀剪下約1cm3的肝片組織在潔凈的載玻片上觸一下。自然干燥后革蘭氏染色鏡檢。染色步驟：火焰固定→滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，1~2min→水洗→滴加革蘭氏碘液1~3min→水洗→95%酒精脫色約，0.5～1min→水洗→石炭酸復(fù)紅（沙黃水）10~30s→水洗→干燥→鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4、細(xì)菌的分離培養(yǎng)：對(duì)于病變明顯的臟器無菌分離細(xì)菌，劃線接種伊紅美藍(lán)和麥康凱平板。用點(diǎn)燃的酒精棉在肝臟表面消毒，然后在酒精燈上加熱手術(shù)刀片，趁熱用刀片在肝臟表面劃一切口，用滅菌接種環(huán)伸入切口的組織內(nèi)。劃線接種在麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察。5、病料處理：采集病變的臟器（脾臟、法氏囊）放入小青瓶，用剪刀粗略剪碎，加PBS緩沖液至不超過2/3小青瓶量，轉(zhuǎn)移到勻漿器，勻漿，將紅色勻漿液倒回小青瓶，標(biāo)記，凍融3次。周二（5月29日）1、雞胚接種：（1）制作病毒液：將昨天凍融備用的小青瓶中的混合臟器研磨液解凍，將上層透明紅色液體裝入EP管中，6000r/min，離心10min。取上清液，用小濾器（0.22um濾膜）過濾入滅菌的小青瓶中。此操作嚴(yán)格在超凈工作臺(tái)完成，以免有細(xì)菌污染，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。（2）照蛋：通過照蛋選取5個(gè)活的7-10日齡的SPF雞胚，避開血管，畫出即將打孔與相應(yīng)氣室處的兩點(diǎn)位置。（3）打孔：碘酊和酒精消毒后用打孔器在酒精燈火焰燒灼消毒后，在氣室處和氣室下的無血管處各鉆一小孔。（4）尿囊腔接種：針頭從氣室下的小孔處插入，深0.5cm，即已穿過了外殼膜且距胚胎有半指距離，注射量為0.1~0.2ml。（如圖1）（5）封孔：點(diǎn)燃酒精燈融化石蠟，用小刷子沾取少量石蠟涂布在兩個(gè)小孔上，注意先封氣室下沿的孔再封氣室處的孔，等待其凝固后，置孵育箱中直立孵育。每24h后，每天照蛋1次，如發(fā)現(xiàn)雞胚死亡立即放入冰箱，于一定時(shí)間內(nèi)不能致死的雞胚亦放入冰箱凍死。死亡的雞胚置冰箱中1-2h后即可取出收毒并檢查雞胚病變。圖1尿囊腔接種2、細(xì)菌的觀察：肉眼觀察麥康凱和伊紅美藍(lán)平板上分離細(xì)菌的菌落形態(tài)，顏色、大小是否一致。3、細(xì)菌的染色：在玻片上滴加一滴生理鹽水，然后分別挑取可疑菌落，涂布玻片，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌染色特征，同時(shí)與將昨天涂布且自然干燥好的組織觸片染色鏡檢，將兩個(gè)細(xì)菌進(jìn)行比較，觀察其是否為同一細(xì)菌。革蘭氏染色方法：火焰固定→滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，1~2min→水洗→滴加革蘭氏碘液1~3min→水洗→95%酒精脫色，約0.5～1min→水洗→石炭酸復(fù)紅（沙黃水）10~30s→水洗→干燥→鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4、細(xì)菌純培養(yǎng)：取兩塊SS瓊脂平板，挑取經(jīng)染色后初步鑒定的細(xì)菌的典型菌落接種到平板上進(jìn)行純培養(yǎng)。5、液體細(xì)菌增殖培養(yǎng)：取裝有氯化鎂孔雀綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、LB液體培養(yǎng)基的試管，一種細(xì)菌接種一套。6、10％的雞紅細(xì)胞制備在注射器內(nèi)事先加入枸鹽酸鈉1ml（抗凝劑與血液按1：4比例使用），抽取1只成年無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞血液4ml。將血液放入離心管內(nèi)，與等體積PBS稀釋液混合至離心管刻度線10ml處，于離心器內(nèi)2000r/min離心5min后，棄去上層透明血漿和白細(xì)胞層，繼續(xù)加PBS稀釋液至10ml離心進(jìn)行紅細(xì)胞的洗滌。重復(fù)3次洗滌后用10倍PBS稀釋液配成10%（V/V）紅細(xì)胞懸液。4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苋?月30日）1、照蛋觀察雞胚：死亡的淘汰，沒死的繼續(xù)培養(yǎng)。2、觀察SS瓊脂平板菌落的形態(tài)及顏色，并記錄。3、觀察LB液體培養(yǎng)基、氯化鎂孔雀綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中細(xì)菌增長(zhǎng)情況。4、藥敏試驗(yàn)：取兩塊LB平板，分別用膠頭吸管吸取LB液體培養(yǎng)基中的液體兩滴，玻璃推棒均勻涂布在LB平板上。將抗菌藥物圓紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，各片距離應(yīng)相等。其中一塊平板為：氨芐西林、哌拉西林、麥迪霉素、氨曲南、鏈霉素、氧氟沙星、頭孢曲松；另一塊平板為卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、氧氟沙星、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢他啶。37oC培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。5、細(xì)菌生化鑒定：將所有生化管中的液體都甩向一側(cè)，然后用砂輪在生化管上端約1/3劃痕，折斷。然后用滅菌接種針取純菌接種至硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖靛基質(zhì)、氨對(duì)14根生化管中。倒置在小燒杯中37℃培養(yǎng)24~48h，觀察發(fā)酵管的反應(yīng)情況，并記錄結(jié)果。（1）糖類（山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖和棉子糖）分解試驗(yàn)：原理：接種細(xì)菌若發(fā)酵某種糖或醇，可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；如發(fā)酵的同時(shí)又產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色的同時(shí)，在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果。產(chǎn)酸，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色，并在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。（2）靛基質(zhì)試驗(yàn)：原理：細(xì)菌能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對(duì)二氨基苯甲醛作用，形成紅色的玫瑰吲哚。結(jié)果判定：接種后24－48h觀察，陽(yáng)性呈紅色，陰性不變色（3）葡磷胨水（MR,甲基紅）試驗(yàn)：原理：細(xì)菌分解培養(yǎng)基中葡萄糖產(chǎn)酸，當(dāng)產(chǎn)酸量大，使培養(yǎng)基的pH值至4.5以下，加入甲基紅指示劑變紅。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果，陽(yáng)性呈紅色；橙色為可疑；黃色為陰性。（4）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)：原理：培養(yǎng)基中以枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸銨為唯一氮源，細(xì)菌若能利用這些鹽作為碳源和氮源而生長(zhǎng)，則利用枸櫞酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽，與利用銨鹽產(chǎn)生的氨氣反應(yīng)，形成NH4OH，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)由草綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。結(jié)果判定：接種培養(yǎng)后48～72h觀察，陽(yáng)性培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色，否則為陰性。（5）硫化氫試驗(yàn)：原理：細(xì)菌分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，與培養(yǎng)基中的醋酸鉛或硫酸亞鐵發(fā)生反應(yīng)，形成黑色的硫化氫或硫化亞鐵。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果，培養(yǎng)液變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性。（6）苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)：原理：若細(xì)菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化鐵指示劑變?yōu)榫G色。結(jié)果判定：接種后24h觀察，變綠色者為陽(yáng)性。（7）氨基酸脫羧酶試驗(yàn)：原理：若細(xì)菌能從賴氨酸或鳥氨酸脫去羧基，導(dǎo)致培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)就顯示出藍(lán)色，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，若不脫羧，培養(yǎng)基不變?yōu)辄S色。結(jié)果判定：接種后覆蓋滅菌液體石蠟，培養(yǎng)4d，每天觀察結(jié)果，陽(yáng)性者培養(yǎng)液先變黃后變?yōu)樗{(lán)色。（8）脲酶試驗(yàn)：原理：細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩分子氨，培養(yǎng)基pH升高，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有脲酶。結(jié)果判定：用接種環(huán)將細(xì)菌培養(yǎng)物接種與尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對(duì)照。1～6h觀察，有時(shí)需要24h到6d。陽(yáng)性反應(yīng)，則瓊脂斜面有粉紅到紫紅色。周四（5月31日）1、參觀江浦農(nóng)場(chǎng)（圖5-7）：通過參觀江浦農(nóng)場(chǎng)畜牧試驗(yàn)站，進(jìn)一步增進(jìn)對(duì)行業(yè)的了解，增進(jìn)理論與實(shí)踐的結(jié)合，為以后的臨床工作奠定良好的基礎(chǔ)。（1）畜牧試驗(yàn)站奶牛場(chǎng)首先參觀的是奶牛場(chǎng)，奶牛場(chǎng)有牛場(chǎng)3棟，每棟1000平米，奶牛200頭，小種牛100頭，場(chǎng)內(nèi)設(shè)有青貯池等設(shè)施。奶牛場(chǎng)采用負(fù)壓自動(dòng)擠奶裝置，有效的避免了奶牛乳房炎等疾病的發(fā)生，并保證了牛奶的衛(wèi)生。在配種方面，采用人工受精，從而減少了奶牛陰道炎以及子宮炎等疾病的發(fā)生，并能確保良種繁育的進(jìn)行。每棟牛場(chǎng)配有各自的運(yùn)動(dòng)場(chǎng)，從而使奶牛有足夠的活動(dòng)空間。而場(chǎng)區(qū)設(shè)有兩條通道，一條為凈道，為飼料，用具以及牛奶的出入通道，一條為污道，為牛糞等的通道，從而保證了牛場(chǎng)的衛(wèi)生。由于目前食品安全問題愈發(fā)受到關(guān)注，牛奶的質(zhì)量必須得到保證，根據(jù)國(guó)家規(guī)定，使用抗生素藥物的奶牛必須有一段停藥期才能采奶，因此奶牛場(chǎng)的奶牛要盡量保證不得病，不使用抗生素藥物，要給奶牛創(chuàng)造良好的生活條件，并提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。（2）南京禾嘉吉升農(nóng)牧發(fā)展有限公司種豬場(chǎng)種豬場(chǎng)同樣分凈道和污道兩條路，進(jìn)入場(chǎng)區(qū)首先要進(jìn)行消毒。消毒后，首先參觀的是保育舍，每個(gè)保育床上有10頭左右的保育豬。后面是哺育舍，仔豬和母豬在一個(gè)哺育床上，而哺育床設(shè)計(jì)確保小豬不會(huì)被母豬壓到。隨后是種豬舍，種母豬采用單圈飼養(yǎng)，并標(biāo)注配種時(shí)間，和妊娠預(yù)測(cè)日期。而種公豬很少，優(yōu)良種公豬的活動(dòng)空間很大，采用單圈飼養(yǎng)，負(fù)責(zé)場(chǎng)區(qū)的配種工作。后面一棟是備用豬舍，選取體型良好的作為后備種母豬或種公豬，一圈飼養(yǎng)10頭左右，采用全自動(dòng)飲水器。在污道旁有一個(gè)展示廳，供買家選豬使用，將豬分批趕到展示廳中，讓買家透過玻璃選取，從而避免了外界病毒細(xì)菌傳入場(chǎng)區(qū)，有效的規(guī)避了傳染病的發(fā)生。（3）金陵黑雞孵育場(chǎng)金陵黑雞孵育場(chǎng)現(xiàn)有禽場(chǎng)8幢，每幢1000平米；其中3幢為鵝場(chǎng)，可按家系飼養(yǎng)；4幢為雞場(chǎng)，規(guī)模化標(biāo)準(zhǔn)化雞籠和喂食喂水采蛋衛(wèi)生設(shè)施一應(yīng)俱全；1幢為人工孵化室，全自動(dòng)控溫控光。而目前主要是孵育金陵黑雞，飼養(yǎng)舍采用籠養(yǎng)，雞舍兩端有風(fēng)機(jī)從而控溫，每只雞年產(chǎn)蛋170多枚。孵化室采用全自動(dòng)控溫控光，從而保證了金陵黑雞的苗雞質(zhì)量。通過此次參觀，了解了奶牛場(chǎng)的基本設(shè)施以及操作規(guī)程，了解了種豬場(chǎng)的豬圈設(shè)置和管理流程，了解了種禽孵育場(chǎng)的管理規(guī)程，學(xué)到了很多書本上沒有接觸到的知識(shí)，為以后的臨床實(shí)踐工作奠定了良好的基礎(chǔ)。而且這次參觀江浦農(nóng)場(chǎng)，讓我們?nèi)绱私嚯x的接觸一線工作，加深了我們對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)傳染病的防控及疾病的了解。2、藥敏試驗(yàn)結(jié)果觀察，記錄；3、生化鑒定結(jié)果觀察，記錄。4、雞胚觀察：照蛋發(fā)現(xiàn)，5個(gè)雞胚仍未死亡，血管清晰明顯，胚體有輕微運(yùn)動(dòng)。拿出兩個(gè)血管較為細(xì)弱的雞胚放入4℃冰箱冷藏致死，直至照蛋發(fā)現(xiàn)血管不明顯時(shí)即可提取尿囊液。周五（6月1日）1、尿囊液的收集（1）在超凈臺(tái)內(nèi)，點(diǎn)上酒精燈，用酒精棉消毒雙手，然后用火焰灼燒后的鑷子夾取碘酊棉消毒雞胚，再用酒精脫碘；（2）用火焰灼燒過的鑷子柄敲破氣室外的卵殼，并小心地一塊塊地取下蛋殼，開口直徑為整個(gè)氣室的大??；（3）再次灼燒鑷子后撕去一氣室下的蛋膜，用消毒過的小鑷子夾起尿囊膜，然后用消毒過的小剪刀剪開一個(gè)小口；（4）用鑷子壓住雞胚用消毒吸管吸取5~8ml尿囊液放入消毒過的小青瓶中，液體應(yīng)清亮，渾濁或有血液則不合格，應(yīng)廢棄，用消毒蓋蓋好。五個(gè)雞胚的尿囊液分別做好標(biāo)記。2、1%紅細(xì)胞制備：用移液槍量取10％紅細(xì)胞懸液400ul，稀釋到4000ul。3、HA試驗(yàn)：①于V型血凝板的每孔滴加PBS50ul，共滴5排；②分別滴加五瓶病毒尿囊液原液（抗原）于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再?gòu)牡?1列孔吸50ul棄去，最后一列不加抗原作為對(duì)照；③于每孔中加入1％紅細(xì)胞懸液50ul，繞圈混勻；④室溫下30～40min，根據(jù)血凝圖象判定結(jié)果，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最多稀釋度為該抗原的血凝滴度，每次4排重復(fù)，以幾何平均值表示結(jié)果。4、HI試驗(yàn)：以4個(gè)單位HA單位的抗原（HA試驗(yàn)中出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度向左退兩孔的抗原稀釋度）進(jìn)行HI試驗(yàn)（1）先取PBS0.05ml加入第1孔，再取4個(gè)HA單位的抗原加入3～12孔，每孔0.05ml，再取8個(gè)HA單位抗原0.05ml加入第2孔；（2）吸被檢血清0.05ml放入第1孔（血清對(duì)照）混勻后吸0.05ml放入第2孔，依次倍比稀釋至12孔，吸0.05ml棄去；（3）室溫下作用20min；（4）每孔加入0.05ml紅細(xì)胞懸液，混勻后室溫靜置30～40min，判定結(jié)果，記錄血清滴度；（5）每次測(cè)定應(yīng)設(shè)定已知滴度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照。5、瓊擴(kuò)試驗(yàn)：（1）從五個(gè)小青瓶中選取最清亮的一瓶病毒尿囊液（抗原）備用。取12支EP管，分為兩組，分別編號(hào)1，2，3，4，5，6；（2）在1號(hào)中加入200ul一種抗原，在2，3，4，5，6各加入200ul的PBS溶液，然后在2號(hào)管內(nèi)再加入200ul的抗原，吹打后后吸出200ul加入3號(hào)管如此倍比稀釋到6號(hào)管，因此病毒尿囊液濃度分別為：原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32；（3）取一塊已凝固的瓊擴(kuò)平板，平均分為四區(qū)，在各區(qū)上打梅花孔（如圖2），孔徑約3mm，孔距約5-6mm，不宜太遠(yuǎn)，打好孔后在火焰上經(jīng)過，封底；在瓊擴(kuò)板的底面上做好標(biāo)記，每區(qū)梅花孔的周圍孔標(biāo)好1、2、3、4、5、6；（4）每區(qū)中間孔加不同標(biāo)號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)血清抗體，周圍孔1~6號(hào)分別加倍比稀釋的病毒尿囊液（原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。置37℃濕盒24h后觀察結(jié)果。12○○6○○○3○○54圖2梅花孔實(shí)習(xí)結(jié)果及分析1.臨床癥狀的觀察病雞體溫升高，拉稀，糞便成白色糊狀，有尿酸鹽沉積，羽毛粗亂，腹部羽毛被糞便污染，呆立不動(dòng)，精神萎靡，眼閉不睜，喜歡打堆，呼吸較急促。2、剖檢病理變化：1、2號(hào)雞的病變不明顯，肝臟稍腫大，有點(diǎn)狀出血；脾臟稍有腫大；法氏囊腫脹明顯。其他臟器并無明顯癥狀。3、組織觸片染色鏡檢（圖2）：肝組織觸片染色后在鏡下觀察到大量被染成紅色的桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)，有的可見菌體兩端深染，疑似大腸桿菌。4、雞感染細(xì)菌鑒定：（1）細(xì)菌分離培養(yǎng)的菌落觀察及染色鏡檢：培養(yǎng)基菌落觀察結(jié)果：培養(yǎng)基細(xì)菌生長(zhǎng)情況固體平板麥康凱平板菌落形態(tài)：粉紅色，表面光滑濕潤(rùn)的連續(xù)菌落。伊紅美藍(lán)菌落形態(tài)：中央黑、邊緣帶有綠色金屬光澤的連續(xù)菌落；邊上長(zhǎng)有少量灰白色的雜菌。染色鏡檢結(jié)果：鏡下有許多紅色桿狀無芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)，有的可見菌體兩端深染。分析：染色鏡檢可以確定該菌未革蘭氏陰性菌，初步判斷為大腸桿菌和沙門氏菌，但是兩者鏡檢形態(tài)基本相同，且均無芽孢，無莢膜或莢膜不明顯，因此，通過涂片鏡檢很難將二者區(qū)分開來，需進(jìn)行進(jìn)一步檢查。我們?cè)谝良t美藍(lán)瓊脂平板上看到有黑色金屬光澤的菌落生成，是大腸桿菌的典型特征；在麥康凱平板上也有粉紅色的菌落生成，更進(jìn)一步說明該菌是大腸桿菌；染色鏡檢發(fā)現(xiàn)其特征與大腸桿菌很符合，所以，結(jié)合以上試驗(yàn)結(jié)果可以說明試驗(yàn)所用雞感染了大腸桿菌，至于有沒有沙門氏菌還得進(jìn)一步鑒定。（2）純培養(yǎng)細(xì)菌觀察結(jié)果：培養(yǎng)基細(xì)菌生長(zhǎng)情況液體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液變渾濁，底部有沉淀。亞硒酸鹽胱氨酸增菌液未見變化氯化鎂孔雀綠增菌液未見變化固體培養(yǎng)基SS瓊脂平板較多的玫紅色菌落，圓形、邊緣光滑、半透明。分析：首先，亞硒酸鹽胱氨酸增菌液和氯化鎂孔雀綠增菌液作為沙門氏菌的選擇性增培養(yǎng)，均有細(xì)菌的增殖，說明該試驗(yàn)用雞未感染了沙門氏菌。5、藥敏試驗(yàn)見下表（見圖4）抑菌圈直徑敏感度>20mm極敏15-20mm高敏10-14mm中敏<10mm低敏0不敏第一組（大腸桿菌）：抗生素氨芐西林呱拉西林麥迪霉素氨曲南鏈霉素氧氟沙星頭孢曲松抑菌圈徑（mm）181281401013-抗生素卡那霉素妥布霉素鏈霉素氧氟沙星氨曲南頭孢吡肟頭孢他啶抑菌圈徑（mm）1213016141220分析：藥敏試驗(yàn)結(jié)果說明，頭孢他啶、氨芐西林及氧氟沙星對(duì)該菌高度敏感，呱拉西林、氨曲南、頭孢曲松、卡那霉素、妥布霉素及頭孢吡肟對(duì)該菌中度敏感，麥迪霉素對(duì)該菌有較低的抑制作用，鏈霉素對(duì)該菌不敏感，所以可用頭孢他啶、氨芐西林及氧氟沙星來治療該病。6、生化試驗(yàn)結(jié)果見下表（見圖3）：硫化氫苯丙氨酸脫氨酶葡萄糖酸鹽葡磷胨水枸櫞酸鹽尿素半固體賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶山梨醇側(cè)金盞花醇木膠糖氨對(duì)靛基質(zhì)--eq\o\ac(○,+)eq\o\ac(○,+)-++++--eq\o\ac(○,+)--注：“＋”表示產(chǎn)酸；“○”表示產(chǎn)氣；“⊕”表示既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；“－”表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。分析：大部分大腸桿菌菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木膠糖、等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大腸桿菌不產(chǎn)生H2S，不利用枸櫞酸鹽且有運(yùn)動(dòng)力，葡磷胨水（MR）試驗(yàn)呈陽(yáng)性，而沙門氏菌能產(chǎn)生H2S，不分解尿素且大多數(shù)無運(yùn)動(dòng)力，葡磷胨水（MR）試驗(yàn)呈陰性。由結(jié)果顯示，未出現(xiàn)典型的沙門氏菌生化試驗(yàn)特征反應(yīng)，故判斷本小組實(shí)驗(yàn)用雞不受沙門氏菌感染，判定該雞感染的致病菌為大腸桿菌。7、照蛋結(jié)果①周三（5月30日）沒有發(fā)現(xiàn)死亡雞胚。②周四（5月31日）將雞胚置于4℃冰箱中，將其凍死。③周五（6月1日）收集尿囊液。本組的雞胚尿囊液均很透明清亮，沒有被細(xì)菌污染。5個(gè)雞胚胚體均正常，沒有見到出血點(diǎn)。8、HA和HI試驗(yàn)結(jié)果與分析：結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：板傾斜，觀察有無紅細(xì)胞呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋度代表一個(gè)血凝單位（HAU）。試驗(yàn)結(jié)果：本次的血凝試驗(yàn)并未出現(xiàn)有血凝現(xiàn)象，從第一孔開始，紅細(xì)胞就未被凝集，都沉于孔底形成小點(diǎn)，傾斜時(shí)都有流淌現(xiàn)象。分析：該待檢的病毒尿囊液中病毒量過小，或者尿囊液中沒有新城疫病毒，該雞群并未受到新城疫病毒的感染。9、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：被檢孔與中心孔形成清晰的沉淀線，并與周邊已知抗原或血清的沉淀先相互融合者，判定為陽(yáng)性；抗原和血清之間產(chǎn)生的沉淀線末端彎向被檢樣品孔內(nèi)側(cè)，判定為弱陽(yáng)性；有的被檢材料會(huì)出現(xiàn)2條以上的沉淀線，其中一條與已知抗原或陽(yáng)性血清的沉淀線融合者，也被判為陽(yáng)性；未出現(xiàn)沉淀線者，為陰性。試驗(yàn)結(jié)果：本組的瓊擴(kuò)試驗(yàn)無沉淀線。則說明雞胚尿囊液中無法氏囊病毒。五、診斷通過細(xì)菌接種、分離培養(yǎng)鑒定及生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，可以確定，我們所分離到的細(xì)菌為大腸桿菌，所以本小組的結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)雞感染了大腸桿菌。同時(shí)，鑒于病毒學(xué)的診斷結(jié)果（無血凝結(jié)果及血凝抑制結(jié)果、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為陰性），我們小組認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)雞并沒有感染病毒。六、防控大腸桿菌病急性時(shí)往往不及救治。所以控制本病重在預(yù)防。糞便污染時(shí)雞大腸桿菌病傳播的主要方式，。所以要嚴(yán)格的對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行消毒，對(duì)雞舍及時(shí)打掃和消毒，盡量減少糞便污染；積極防控原發(fā)病也是關(guān)鍵，在購(gòu)買雛雞時(shí)要選取消毒嚴(yán)格的孵化廠家，避免孵化期大腸桿菌的感染，選取健雛，適時(shí)的注射疫苗，若發(fā)現(xiàn)患雞，必須隔離并進(jìn)行治療，可根據(jù)我們的藥敏試驗(yàn)選用敏感度比較好的藥物。由于3周以后的雞生長(zhǎng)速度特別快，機(jī)體的主動(dòng)免疫功能不能同步發(fā)育，因此3~6周齡的雞最易