硫酸銨溶液飽和度

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用第二章沉淀法沉淀法是純化生物大分子常用的一種經(jīng)典方法。該法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，一般包括鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀和選擇性沉淀等類(lèi)型。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院22023/9/11生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)51班3第二章沉淀法基本原理蛋白沉淀法123核酸沉淀法第一節(jié)沉淀的基本原理沉淀法也稱(chēng)溶解度法。其純化生物大分子的基本原理是：根據(jù)各種物質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異（如蛋白分子表面的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)之間比例的差異）來(lái)改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)（如pH、極性、離子強(qiáng)度、金屬離子等），就能致使抽提液中有效成分溶解度的變化。則可通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)某樘崛軇┦褂蛛x的有效成分最大溶解，而雜質(zhì)最小溶解；或者相反。從而達(dá)到分離的目的。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院42023/9/114南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)沉淀的基本原理蛋白沉淀法：

鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法核酸沉淀：有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法其它沉淀劑沉淀法：聚乙二醇（PEG），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），LiCl，精胺，鈣鹽。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院55南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院聚乙二醇沉淀法選擇性沉淀法結(jié)晶沉淀法第二節(jié)蛋白沉淀法1.鹽析法原理：根基蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增高而上升（鹽溶）但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出（鹽析）。鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。

2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院66南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院72023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院8第二節(jié)蛋白沉淀法1.鹽析法鹽的選擇一般蛋白沉淀時(shí)選用硫酸銨，原因：溶解度大，對(duì)溫度不敏感分級(jí)效果好有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用價(jià)格低廉，廢液可以肥田鹽析的缺點(diǎn)：樣品繼續(xù)純化時(shí)須脫鹽。硫酸銨的缺點(diǎn)是銨離子干擾雙縮脲反應(yīng)，為蛋白質(zhì)的定性分析造成一定困難。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院99南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)蛋白沉淀法1.鹽析法硫酸銨鹽析固體法。在大體積粗制品溶液中逐步加入固體硫酸銨，當(dāng)達(dá)到一定飽和度時(shí)，蛋白質(zhì)便可沉淀下來(lái)。飽和溶液法。較固體法溫和，但不適用于大體積樣品，會(huì)導(dǎo)致樣品體積大量增加。透析法。將盛蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過(guò)透析作用改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度。該法鹽濃度以連續(xù)狀態(tài)變化，避免局部鹽濃度過(guò)高的不良影響，分級(jí)效果好。但受透析袋容積、鹽析速度、及硫酸銨耗費(fèi)大的制約，僅用于精確、樣品體積小的試驗(yàn)中。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1010南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院硫酸銨鹽析固體法g=533(S2-S1)/(100-0.3S2)(20℃)g=541(S2-S1)/(100-0.3S2)(20℃)g：1升溶液中需加入固體硫酸銨的克數(shù)S1：表示需要達(dá)到的百分飽和度S2：表示原溶液中的百分飽和度飽和溶液法V=V0(S2-S1)/(S3-S1)V：表示需要加入的硫酸銨溶液體積（ml）V0：表示原來(lái)溶劑的體積（ml）S1與S2同上S3：表示需要加入的硫酸溶液的飽和度2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1111南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院硫酸銨分級(jí)沉淀示例：各溶解度區(qū)段的沉淀效果（尿素酶）：2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院12名稱(chēng)沉淀效果硫酸銨飽和度/%（25℃）0~2525~3535~4545~5555~65沉淀物酶活力單位/U011268503020272023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院13調(diào)整硫酸溶液飽和度計(jì)算表第二節(jié)蛋白沉淀法1.鹽析法鹽析的影響因子：蛋白質(zhì)濃度對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)濃度過(guò)大，鹽析時(shí)發(fā)生共沉現(xiàn)象，分離效果不好；蛋白質(zhì)濃度太稀，耗鹽量過(guò)大，蛋白質(zhì)回收率也低。一般控制樣品液蛋白濃度在0.2%-2%為宜。離子強(qiáng)度和離子類(lèi)型對(duì)鹽析的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低，越容易產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象；離子半徑小而價(jià)數(shù)高的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而價(jià)數(shù)低的離子對(duì)鹽析影響弱。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1414南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鹽析的影響因子：ＰＨ對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，溶解度越大；在凈電荷為零時(shí)，溶解度最低。一般將ＰＨ值調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，這樣有利于鹽析。溫度對(duì)鹽析的影響：在低離子強(qiáng)度或水中在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增加；但在高鹽溶液中，溫度的升高有時(shí)反而下降。一般情況下在０~４℃操作。其他：在進(jìn)行鹽析沉淀時(shí)，有時(shí)需在溶液中加入一定量EDTA，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。再者是加硫酸銨的時(shí)間要控制好，一般2h左右。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1515南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)蛋白沉淀法2.有機(jī)溶劑沉淀法原理：有機(jī)溶劑對(duì)許多溶于水的小分子生化物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子都能發(fā)生沉淀作用。有機(jī)溶劑的沉淀作用主要是降低溶液的介電常數(shù)從而增強(qiáng)分子之間的相互作用，使其溶解度降低。對(duì)于具有表面水層的生物大分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑可破壞溶質(zhì)分子表面的水膜，使這些大分子脫水而相互聚集析出。不同溶質(zhì)要求不同濃度的有機(jī)溶劑，因此可用有機(jī)溶劑進(jìn)行分步沉淀。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1616南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院17第二節(jié)蛋白沉淀法2.有機(jī)溶劑沉淀法常用溶劑：甲醇、乙醇、丙酮。優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑沉淀法分辨能力比鹽析法高，沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易。缺點(diǎn)：對(duì)某些具有生物活性的大分子，容易引起變性失活，操作常在低溫下進(jìn)行；分離效果差，共沉作用大；離子強(qiáng)度及離子種類(lèi)對(duì)其也有影響。2023/9/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1818南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)蛋白沉淀法3.蛋白質(zhì)沉淀法針對(duì)某一類(lèi)或某一種蛋白的沉淀法，常見(jiàn)沉淀劑有：堿性蛋白質(zhì)：多價(jià)陽(yáng)離子的堿性蛋白質(zhì)，如魚(yú)精蛋白，除能有效沉淀核酸外，還能沉淀某些蛋白質(zhì)。凝集素：凝集