第九課電泳圖譜的圖像分析

第九課電泳圖譜的圖像分析第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月回顧FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳圖譜的圖像分析簡介

whatcanwegetfromimageanalysis?雙向凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究的主要技術(shù)之一,雙向電泳根據(jù)等電點(diǎn)和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，經(jīng)染色后蛋白質(zhì)再PAGE上可形成密度不同、分布不均的復(fù)雜點(diǎn)圖譜。如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測、定量、比較、分析和歸類，挖掘有價值的蛋白質(zhì)點(diǎn)的信息是雙向電泳分析軟件所要解決的問題。第3頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月PDQuest軟件簡介PDQuest軟件是顯示（imaging）、分析（analyzing）雙向電泳圖譜＆數(shù)據(jù)庫查詢的一個軟件包硬件：一定的電腦配置,Pentirm166處理器，64M內(nèi)存，3G硬盤，1024*768分辨率，256色，SCI接口，windows操作系統(tǒng)軟件：

PDQuest雙向凝膠圖像分析軟件，Bio-RadLaboratory,Hercules,CA第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月PDQuest軟件的使用以PDQUEST2-D分析軟件為例將雙向電泳分析的基本實(shí)驗(yàn)過程做一簡單介紹。第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠的圖像處理分析及細(xì)胞蛋白譜的建立

典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞（report）2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月PDQuest軟件PDQUEST2-D分析軟件系統(tǒng)和其他2-D分析軟件系統(tǒng)一樣，包括：一圖象采集與加工：二斑點(diǎn)檢測三斑點(diǎn)匹配四數(shù)據(jù)分析及輸出第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月PDQuest軟件的使用/download/pdquest/Lessons/interface.htm第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月一、圖象采集與加工

(editingimages)

第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1、掃描：凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，全彩RGB,分辨率為400dpi-800dpi，盡量排除氣泡，文件以tiff格式保存。2、圖片加工：在PDQUEST2-D分析軟件中打開以tiff格式保存的文件可以。（單擊“打開文件”圖標(biāo)和“File”菜單并選擇“Open”命令，選擇保存2-D圖象文件的磁盤、路徑和文件名，雙擊文件名或單擊“Open”以打開2-D圖象文件，此時tiff格式保存的文件會自動另外創(chuàng)建一個為PDQUEST2-D分析軟件自定義的文件格式2DScan。）單擊工具欄上的controlthe

imagedisplay

圖標(biāo)，會出現(xiàn)一個對話框，通過改變此對話框的High和Low的值以改變明亮度。第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月用工具欄的crop可以切割掉凝膠邊緣沒有蛋白質(zhì)點(diǎn)的部分，以減少分析的復(fù)雜性，但要注意對你要分析的多塊凝膠圖像最好是切割成同樣大小。

（在操作時先選擇其中的一個凝膠圖象并選定要切割的區(qū)域，然后在image>advancecrop>savecropsettings下保存crop的設(shè)定條件并輸入保存的名稱，其他的圖象切割時在image>advancecrop>loadcropsettings中選定先前保存的名稱即可）

第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月二、斑點(diǎn)檢測

(spotsdetection)第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月圖象采集與加工后就要進(jìn)行斑點(diǎn)檢測，PDQUEST2-D分析軟件通過一個稱之為“蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測向?qū)В╯potidentificationwizard）”的程序來實(shí)現(xiàn)的。第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月單擊“spot”菜單，選擇“spotidentificationwizard”程序。該程序首先需人工設(shè)定檢測參數(shù)如最小斑點(diǎn)、最弱斑點(diǎn)、最大斑點(diǎn)、最小斑點(diǎn)和背景值,然后程序進(jìn)行自動檢測并可調(diào)節(jié)檢測的靈敏度，若檢測效果不理想，該步驟可反復(fù)進(jìn)行。程序允許人工調(diào)節(jié)脫尾（streaks）、背景、斑點(diǎn)（speckles）和其他一些選項(xiàng)等。這些參數(shù)設(shè)好后單擊Findspotcenters,其結(jié)果在凝膠圖象會顯示檢測到的斑點(diǎn)會用“

字（SpotCrosshairs）”表示，檢測的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)應(yīng)盡量與肉眼觀測的相符。在ParameterSet項(xiàng)輸入保存的名稱，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的參數(shù)可被保存，并能用保存的參數(shù)自動檢測所有2-D凝膠中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，單擊Processallgels，會出現(xiàn)一個Auto-detectspots窗口，其中可以選擇需要進(jìn)行斑點(diǎn)檢測的凝膠圖象（這些凝膠圖像需事先打開）。蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測完了之后，軟件會自動創(chuàng)建另外兩種格式分別為gelimage和gelspot。第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月由于在進(jìn)行斑點(diǎn)檢測時會錯誤的識別一些蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，比如將一些污染的非蛋白質(zhì)點(diǎn)識別為蛋白質(zhì)點(diǎn)、將本來是一個蛋白質(zhì)點(diǎn)識別為兩個蛋白質(zhì)點(diǎn)或者反之。所以在匹配之前最好進(jìn)行處理，同時將gelscan、gelimage和gelspot圖打開，然后單擊editspottool，出現(xiàn)一個對話框，此對話框中有增加斑點(diǎn)（makeaspotatcursor）,刪除斑點(diǎn)（removespotatcursor）,合并斑點(diǎn)（combinespotinbox）等圖標(biāo)，可根據(jù)你的目的而選擇其中一個圖標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)的斑點(diǎn)處理。這些處理只能在gelimage圖象中處理，但相應(yīng)的在gelspot圖象中會同時得到顯示。第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三、斑點(diǎn)匹配

(Matchingspots)第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測完了之后，為了比較和分析不同凝膠中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的改變，PDQUEST可以建立一個Matchset。單擊match>creatmatchset,出現(xiàn)一個Matchset的對話框，輸入文件名稱，保存路徑，選擇（select）或上載（load）gelspot圖像的文件名，然后單擊creat,出現(xiàn)一對話框，選擇其中的一個圖象做為參考圖象（standardmember）,整個Matchset用單個窗口（signalwindow）來表示，其中的亞窗口（subwindow）分別用來表示參考圖像（用REF來表示）和成員膠（membergel）圖像。第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月Matchset建成后，接著便是設(shè)立標(biāo)志點(diǎn)（landmark）,它的作用是對整個凝膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行排列（align）與定位（position）以便進(jìn)行匹配（match）。

單擊工具欄中的matchtools圖標(biāo)會出現(xiàn)一個窗口，其中有l(wèi)andmark,unlandmark,matchgel,matchallgels等斑點(diǎn)匹配的工具,在match菜單中也有這些工具。

標(biāo)志點(diǎn)應(yīng)選擇分辨良好，且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并盡量避開蛋白質(zhì)斑點(diǎn)聚集的地方，最好在不同的放大倍數(shù)下確定該蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為所有成員膠上同一個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。至少要設(shè)立兩個標(biāo)志點(diǎn)后便可利用PDQUEST的自動匹配功能來完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的匹配了。一般設(shè)立的landmark斑點(diǎn)個數(shù)為總斑點(diǎn)的10%左右，要用肉眼檢查每一個應(yīng)該能匹配上的斑點(diǎn)是否匹配上了。

第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月對錯誤匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)或沒有識別到的匹配可進(jìn)行手工方式編輯。在這里也可以進(jìn)行編輯斑點(diǎn)功能，單擊view>interchangeallimages,這樣所有的成員膠和參考膠有Gelspot狀態(tài)下變成了Gelimage,而在Gelimage狀態(tài)下可進(jìn)行EditSpotTools以編輯蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)志點(diǎn)以綠色三角標(biāo)記，每塊膠上匹配上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)以綠色字母標(biāo)記，沒有匹配上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用紅色圈來標(biāo)記，即是有無差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月四、數(shù)據(jù)分析及輸出

（analysisandreport）第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月為了分析蛋白質(zhì)斑點(diǎn)之間差異表達(dá)，PDQUEST提供了多個分析程序，包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)量(Quantity)分析，散點(diǎn)圖工具（SatterPlotTool）,量的柱狀圖分析（Graph）等在內(nèi)的多種分析程序。第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月量的分析打開Matchset，單擊Database>Analysis>CreateAnalysisSet,然后再單擊參考圖，就會出現(xiàn)一個對話框,輸入名字（Name）,Type有多種選項(xiàng),要做量的比較就選Quantitative。第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月比較（Compare）形式有兩種，一種是Gel,可以單個的膠兩兩互相比較(只能是成員膠和參考膠進(jìn)行比較)，另一種是Group，可以將同一樣品的多塊膠做為一組（這在Database>ReplicateGroup>CreateGroup下可以創(chuàng)建組），然后再組之間兩兩比較。然后再選擇A和B，分別表示兩塊膠或者是兩組膠。ReplicateGroup第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月在SelectSpotsWhichare中可以選擇Increased,IncreasedorDecreased或者是Decreased等，激活選項(xiàng)后可以輸入倍數(shù)關(guān)系,默認(rèn)的是2times,可以輸入其他數(shù)值，如3times。參數(shù)設(shè)好后就單擊go,在參考膠上就會出現(xiàn)黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，如果你選擇是IncreasedB>A2times,那么這些黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)即為在量上B大于A兩倍的蛋白質(zhì)點(diǎn).第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月為了矯正銀染對蛋白質(zhì)點(diǎn)定量分析的影響，所有點(diǎn)的含量通過單個點(diǎn)的光密度值比上膠上所有點(diǎn)光密度質(zhì)而正常化（Normalize）,單擊Edit>Normalize,出現(xiàn)一對話框，選擇左上角EnableNormalize，下面的窗口被激活，在Basis下選擇TotalofallValidSpots,在Scaling下選擇PPM(×1000000),然后單擊

go。這樣所有的點(diǎn)都正?；∟ormalize）了。

歸一化Normalization第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月散點(diǎn)圖工具Scatterplot第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月單擊Reports下的Scatterplot，會出現(xiàn)散點(diǎn)圖分析的對話框，可以選擇x,y軸，分別代表一塊膠，Markers下可以選擇倍數(shù)，下面的散點(diǎn)圖即顯示了兩個2-D膠圖像中蛋白質(zhì)點(diǎn)之間的相關(guān)性，上面會顯示二者的相關(guān)系數(shù)，如果相關(guān)系數(shù)大于0.4，說明二者有較大的相關(guān)性，如果小于0.4大于0.2,說明相關(guān)性較小，小于0.2,說明沒有相關(guān)性。在Reports>Scatterplots下可以將所有的凝膠圖之間的相關(guān)圖都打印出來。

第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月量化柱狀圖Graphs第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月單擊Reports>MoreGraphs>PageGraphs,在有邊會出現(xiàn)一對化框，顯示所有蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同膠上的量化柱狀圖，如果要顯示所要分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)的量化柱狀圖，則在對話框的Input下選擇Analysisset,出現(xiàn)一對話框，然后選擇分析的名稱即可。在Reports>QuantityGraphs下可輸出所有的蛋白質(zhì)點(diǎn)（AllMatchSpots）或者是特定分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)（SpecificdAnalysisSet）在不同膠上的量化柱狀圖。

第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月ProteomicsAnanlysisintheControlandExperimental

第56頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用材料：第57頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月無腔眼金魚胚胎正常眼金魚胚胎第58頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月差異點(diǎn)：第60頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月量化柱狀圖：第61頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2DGelDatabasesBiobase角質(zhì)形成細(xì)胞,膀胱癌等(丹麥CenterforGenomeResearch)http://biobase.dk/cgi-bin/celisECO2DBASE大腸桿菌(在NCBI庫中)/respository/ECO2DBASEHe