試驗(yàn)樣品再分析研究進(jìn)展

試驗(yàn)樣品再分析研究進(jìn)展

生物樣品分析的主要指標(biāo)之一是該方法的再現(xiàn)。特別是在同一實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)樣本經(jīng)過兩次或多次獨(dú)立測試，結(jié)果的一致性。在生物樣品分析方法驗(yàn)證中,通常評價(jià)方法的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度,以及在不同條件下方法的重現(xiàn)性。在大部分情況下,方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)樣和質(zhì)控樣品是在體外用相應(yīng)的生物基質(zhì)配制的,例如空白血漿等。雖然人們盡可能使配制的標(biāo)樣和質(zhì)控樣品與試驗(yàn)樣品相似,但是試驗(yàn)樣品仍然可能在許多方面與這些配制的樣品有差異。對于小分子藥物,試驗(yàn)樣品中可能存在藥物的代謝物,而標(biāo)樣和質(zhì)控樣品都不含有這些代謝物。如果某種代謝物在體外轉(zhuǎn)化回母體藥物,則分析結(jié)果可能不重現(xiàn)。在此情況下,如果涉及轉(zhuǎn)化的代謝物和母體藥物都被測定,或許可以通過傳統(tǒng)的分析方法驗(yàn)證程序發(fā)現(xiàn)這一問題。但是,如果不測定相應(yīng)的代謝物,通過傳統(tǒng)的分析方法驗(yàn)證,則可能觀察不到某些影響重現(xiàn)性的問題,而僅在試驗(yàn)樣品分析中出現(xiàn)。筆者將對小分子藥物試驗(yàn)樣品再分析的意義和避免失敗的對策的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述,希望我國的生物樣品分析工作者關(guān)注這一重要問題。1重復(fù)分析試驗(yàn)早在1992年,加拿大藥品管理部門的指導(dǎo)原則中曾規(guī)定,隨機(jī)選擇15%的試驗(yàn)樣品進(jìn)行再分析,作為生物利用度和生物等效性試驗(yàn)的一部分?？赡苡捎谌狈山邮軜?biāo)準(zhǔn),這一要求在2003年被取消。但是,美國FDA后來發(fā)現(xiàn),許多在實(shí)驗(yàn)前驗(yàn)證中,精密度和準(zhǔn)確度得到證明的分析方法,對受試者實(shí)際樣品測試結(jié)果卻不能重現(xiàn),再次測量值與原始測量值相差達(dá)到3倍之多。2006年5月,在美國藥學(xué)會(huì)(AAPS)/美國食品藥品管理局(USFDA)生物分析工作組第3次會(huì)議上,FDA提出,在臨床前和臨床試驗(yàn)中,都需要進(jìn)行試驗(yàn)樣品再分析(ISR)。此后,ISR在許多生物分析會(huì)議上被廣泛討論,專家們推薦了進(jìn)行ISR試驗(yàn)樣品的類型和數(shù)目、數(shù)據(jù)分析方法以及如何報(bào)告結(jié)果。歐盟藥品管理局EMA在2011年頒布的生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中,將ISR明確作為一項(xiàng)要求。《中國藥典》2015年版相關(guān)指導(dǎo)原則草案中,對此提出了同樣的要求。美國FDA最近的生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(草案)提出,通過重復(fù)測試試驗(yàn)樣品,來評估生物分析方法的重現(xiàn)性。這些指導(dǎo)原則的具體規(guī)定見表1。ISR主要用于確定報(bào)告的受試者樣品中分析物濃度是否可靠。通過在不同天的另外分析批中,重復(fù)分析試驗(yàn)中受試者的部分樣品,原始分析和再分析均使用同樣的生物分析方法,對通過配制質(zhì)控樣品獲得的分析方法精密度和準(zhǔn)確度提供關(guān)鍵性的支持。目前,ISR已經(jīng)成為歐盟和美國生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中的一項(xiàng)基本要求,不僅被工業(yè)界廣泛接受,而且近期在國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表的研究論文都包括了相關(guān)內(nèi)容。國際上一些實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了各自ISR實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。例如,美國生物分析實(shí)驗(yàn)室TandemLabs從2008年1月到2009年12月,共進(jìn)行了250多個(gè)不同分析物的ISR檢測,其中9個(gè)分析物的最初ISR檢測不合格。印度一個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室在2008~20092年中,共測試ISR樣品9587個(gè),其中處于合格范圍的樣品9261個(gè),合格率為96.6%。對于經(jīng)ISR檢測沒有通過的項(xiàng)目,各實(shí)驗(yàn)室隨后進(jìn)行了詳盡的調(diào)查研究,以確定每項(xiàng)試驗(yàn)ISR檢測失敗的根本原因。根據(jù)歐洲生物分析協(xié)會(huì)的一項(xiàng)調(diào)查,在220項(xiàng)臨床前生物樣品分析試驗(yàn)中,有8項(xiàng)ISR不合格,其中分析方法缺陷4項(xiàng),人為失誤4項(xiàng);在295項(xiàng)臨床生物樣品分析試驗(yàn)中,有12項(xiàng)ISR不合格,其中分析方法缺陷7項(xiàng),人為失誤5項(xiàng)。2不能重復(fù)使用的原因有幾個(gè)2.1測定樣品的重現(xiàn)性差近年來,文獻(xiàn)中報(bào)道了通過試驗(yàn)樣品再分析,發(fā)現(xiàn)生物樣品定量分析方法不能重現(xiàn)的許多實(shí)例。實(shí)例1:氯吡格雷(clopridogrel):氯吡格雷是強(qiáng)效抗血小板藥,它是一種前藥,吸收后經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450酶氧化,然后水解產(chǎn)生活性的含巰基代謝物。建立了一種高靈敏度的LC-MS/MS方法,測定人血漿中的氯吡格雷,以氯吡格雷-d3為內(nèi)標(biāo),樣品預(yù)處理采用乙酸乙酯提取,定量下限為25pg·mL-1。在ISR實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)4個(gè)測定值不符合接受標(biāo)準(zhǔn),比原始值低51%以上。深入考察發(fā)現(xiàn),在樣品處理過程中加入酸性緩沖液,是導(dǎo)致ISR失敗的原因。氯吡格雷的解離常數(shù)為pKa4.3,方法建立時(shí),為了獲得定量和精確的提取回收率,提取過程中加入了pH3的緩沖液,在此條件下,質(zhì)控樣品的精密度和準(zhǔn)確度均符合要求,但受試者樣品測定的重現(xiàn)性差,所以重新開發(fā)了分析方法,使用更溫和的酸性條件pH6進(jìn)行提取和樣品處理,提取回收率雖然有3%~5%降低,但對靈敏度影響不大。實(shí)例2:美沙拉嗪(mesalamine):美沙拉嗪即5-氨基水楊酸,是廣泛用于治療結(jié)腸炎等疾病的藥物。建立了測定人血漿中美沙拉嗪的LC-MS/MS方法,定量下限為5.0ng·mL-1。在進(jìn)行ISR實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)ISR-1測得值與原始值有9.2%~96.8%的正偏差。但是再次ISR實(shí)驗(yàn),即ISR-2和ISR-3,則沒有觀察到與ISR-1有明顯偏差。通過調(diào)查,該問題的原因被認(rèn)定是由血漿樣品的非均一性導(dǎo)致,初次分析時(shí)沒有經(jīng)過充分的渦旋混勻,屬于樣品處理失誤。改正措施包括降低采集、儲(chǔ)存和處理血漿的體積,使之不超過試管容積的50%。實(shí)例3:西地那非(sildenafil):西地那非是廣泛使用的口服治療ED的藥物。設(shè)計(jì)了簡便的LC-MS/MS方法,測定人血漿中的西地那非和N-去甲基西地那非,分別采用西地那非-d3和N-去甲基西地那非-d8作為內(nèi)標(biāo)。在ISR實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),樣品中N-去甲基西地那非的測定值比原始值低41.5%~61.8%,而母體藥物的測定值均在接受范圍之內(nèi)。進(jìn)一步考察結(jié)果發(fā)現(xiàn),受試者樣品中N-去甲基西地那非的穩(wěn)定性與溫度相關(guān),可能在血漿中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為N,N-雙去甲基西地那非。據(jù)此,分析人員調(diào)整了樣品預(yù)處理溫度,經(jīng)過穩(wěn)定性考察和重新驗(yàn)證,在低于10℃條件下處理樣品后測試,所有ISR結(jié)果都符合接受標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)例4:雷貝拉唑(rabeprazole):雷貝拉唑是質(zhì)子泵抑制劑,具有取代的苯并咪唑結(jié)構(gòu)。開發(fā)了測定人血漿中雷貝拉唑的LC-MS/MS方法,以奧美拉唑?yàn)閮?nèi)標(biāo),采用固相萃取方法處理樣品,定量下限為1ng·mL-1。在ISR試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)所有樣品測試結(jié)果都處于接受范圍之外(從-69.8%到-20.7%)。通過多次ISR試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)雷貝拉唑的穩(wěn)定性和環(huán)境關(guān)系極大。原始分析是在高溫干燥的夏季進(jìn)行的,而ISR試驗(yàn)是在時(shí)隔3個(gè)月之后的雨季進(jìn)行。直到采用經(jīng)過控制的實(shí)驗(yàn)環(huán)境[溫度(22±3)℃,濕度50%~70%],才取得了與原始值一致的ISR結(jié)果。據(jù)此,作者建議ISR樣品分析應(yīng)該在樣品原始分析后立即進(jìn)行,特別是對于非常不穩(wěn)定的藥物。此外,文獻(xiàn)報(bào)道抗病毒藥洛匹那韋的血漿樣品分析ISR結(jié)果失敗,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)以干血斑濾紙采集的樣品ISR結(jié)果合格,說明在不同環(huán)境下該藥物試驗(yàn)樣品的穩(wěn)定性不同。吸附在濾紙上的血漿樣品中,代謝酶的空間結(jié)構(gòu)被破壞。2.2組樣品的干擾及統(tǒng)計(jì)分析綜合文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道,造成試驗(yàn)樣品再分析結(jié)果不能重現(xiàn)的可能原因很多。例如有穩(wěn)定性問題:代謝物回復(fù)轉(zhuǎn)化為其母體化合物,藥物轉(zhuǎn)化為異構(gòu)體,或pH影響穩(wěn)定性;受試者樣品中藥物與蛋白結(jié)合的差異;與基質(zhì)干擾有關(guān)的問題,包括血漿中磷脂的干擾和其他物質(zhì)的干擾;合并用藥的影響;樣品預(yù)處理步驟,例如提取效率的變異;生物樣品的非均一性;制劑的影響;生物分析方法固有的問題,例如方法不耐用;內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的變異;實(shí)驗(yàn)中使用的材料、試劑和溶液的影響;儀器設(shè)備的影響;人為失誤的影響,例如分析人員缺乏經(jīng)驗(yàn)以及非故意的失誤。對于試驗(yàn)樣品再分析,應(yīng)該充分運(yùn)用已有的法規(guī)和指南,例如GLP,GCP,以及良好的實(shí)驗(yàn)記錄。必須仔細(xì)考察失敗的數(shù)據(jù),并確定根本原因。在不能確定原因的情況下,可以根據(jù)樣品體積,在不同的批次中再分析2次或多次。評價(jià)所有相關(guān)批次的結(jié)果,以獲得日間ISR數(shù)據(jù)。實(shí)施方案一般分為:目的或假設(shè);實(shí)驗(yàn)步驟;結(jié)果;結(jié)論。作為調(diào)查結(jié)論,應(yīng)該包括ISR結(jié)果不重現(xiàn)的原因,評估分析方法的可靠性,評估原來數(shù)據(jù)的可靠性,評估是否需要重新分析所有試驗(yàn)樣品,使用已有分析方法還是修正后的分析方法。3避免再次分析失敗的對策3.1生物等效性試驗(yàn)調(diào)查ISR失敗原因的過程通常很繁瑣,并且耗費(fèi)大量的人力資源和時(shí)間。為防止ISR失敗,在方法開發(fā)的早期就應(yīng)采取預(yù)防措施。文獻(xiàn)報(bào)道的諸多案例表明,導(dǎo)致ISR失敗最根本的原因是由于藥物或其代謝物的不穩(wěn)定,另一個(gè)主要原因是基質(zhì)效應(yīng)。針對這些原因,可以在建立分析方法時(shí)采取一些必要的措施。實(shí)例1:曲馬多(tramadol):在定量分析血漿中曲馬多及其代謝物O-去甲曲馬多時(shí),樣品中存在沒有被定量的代謝物N-去甲曲馬多,它與O-去甲曲馬多的分子量相同,可能干擾后者的定量,并且可能導(dǎo)致計(jì)算濃度的變異?；谶@些從文獻(xiàn)中得到的信息,分析人員首先優(yōu)化了O-去甲曲馬多的質(zhì)譜條件,以避免檢測N-去甲曲馬多。進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件,使O-去甲曲馬多和N-去甲曲馬多獲得色譜分離,確保分析方法不受N-去甲曲馬多的干擾,并且準(zhǔn)確測定O-去甲曲馬多。此外,發(fā)現(xiàn)受試者血漿中O-去甲曲馬多葡萄糖苷酸的濃度也很高,在方法驗(yàn)證時(shí)評價(jià)了該代謝物的穩(wěn)定性,證明在分析條件下不發(fā)生分解,不影響準(zhǔn)確定量O-去甲曲馬多。實(shí)例2:氟伐他汀(fluvastatin):氟伐他汀是一種降血脂藥,它是由2種赤式立體異構(gòu)體組成的外消旋體混合物,在體內(nèi)代謝為2種蘇式立體異構(gòu)體。開發(fā)了分離氟伐他汀及其蘇式異構(gòu)體的LC-MS/MS方法,并用于制劑生物等效性試驗(yàn)。在試驗(yàn)樣品分析中,觀察到一個(gè)額外的色譜峰,與氟伐他汀的質(zhì)譜有部分相同,并干擾氟伐他汀的定量。隨后,改進(jìn)了色譜條件,使氟伐他汀和該干擾物質(zhì)得到分離。進(jìn)行了全面評價(jià),確定該干擾物質(zhì)不是樣品處理過程中的分解產(chǎn)物。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了氟伐他汀的一種異構(gòu)體化合物,須通過色譜分離,以獲得可靠的生物分析方法。研究提示,該干擾物質(zhì)是在體內(nèi)生成,可能是氟伐他汀的一個(gè)代謝物,它是血漿中的主要代謝物之一,藥動(dòng)學(xué)行為與氟伐他汀不同。實(shí)例3:雷米普利(ramipril):雷米普利是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的強(qiáng)效抑制劑。在口服吸收后,迅速水解為活性代謝物雷米普利拉,也產(chǎn)生其他I相代謝物和各種葡萄糖醛酸結(jié)合物。其中,?；咸烟擒账岷蚇-葡萄糖苷酸特別不穩(wěn)定,在樣品采集、儲(chǔ)存和提取過程中,甚至在樣品處理后,都容易發(fā)生回復(fù)轉(zhuǎn)化。為同時(shí)測定雷米普利和雷米普利拉,分析方法開發(fā)中兩個(gè)主要挑戰(zhàn)是色譜分離和代謝物回復(fù)轉(zhuǎn)化。因?yàn)槠咸烟擒账釙?huì)在離子源中裂解,產(chǎn)生母體藥物信號(hào)。獲得良好的峰形,確保色譜峰的唯一性也很重要。由于分析物的性質(zhì),使峰的分裂和變寬時(shí)常發(fā)生。需要選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相組成和柱溫,并實(shí)現(xiàn)母體藥物和I相代謝物以及葡萄糖醛酸結(jié)合物的色譜基線分離。雷米普利的?；咸烟擒账釢舛燃s為60ng·mL-1,如何控制其分解,使生成的雷米普利低于定量下限的20%(即40pg·mL-1),是一項(xiàng)難度很大的任務(wù)。作者采用臨床先導(dǎo)試驗(yàn),分析新采集的試驗(yàn)樣品,驗(yàn)證開發(fā)的方法,然后才將其用于正式的臨床試驗(yàn)。結(jié)果證明,使用雷米普利?；咸烟擒账岽x物和試驗(yàn)樣品,對于方法開發(fā)和驗(yàn)證,保證其重現(xiàn)性和耐用性非常關(guān)鍵。盡管比常規(guī)的方法驗(yàn)證耗費(fèi)了更多的時(shí)間和費(fèi)用,但通過方法的可靠性得到了補(bǔ)償。實(shí)例4:螺內(nèi)酯(spironolactone):在一項(xiàng)螺內(nèi)酯制劑的生物等效性試驗(yàn)中,采用LC-MS/MS分析方法測定螺內(nèi)酯及其活性代謝物坎利酮。進(jìn)行了2次ISR考察,一次是在試驗(yàn)結(jié)束之后馬上進(jìn)行,另一次是在遠(yuǎn)超出方法驗(yàn)證的長期穩(wěn)定性(3個(gè)月)期限之后。在第一次ISR考察中,2個(gè)分析物的結(jié)果都符合重現(xiàn)性要求。但在第二次考察中,螺內(nèi)酯的測定值與原始測定值相比,顯示出負(fù)偏差,ISR不合格;對于坎利酮,盡管觀察到系統(tǒng)的正偏差,但仍然滿足ISR合格標(biāo)準(zhǔn)。這一結(jié)果說明,在-40℃長期保存下,螺內(nèi)酯部分轉(zhuǎn)化為坎利酮。由于螺內(nèi)酯的血漿濃度低于坎利酮,所以這一轉(zhuǎn)化尚未造成坎利酮的ISR結(jié)果超標(biāo)。該項(xiàng)研究提示,生物等效性試驗(yàn)數(shù)據(jù)必須在分析方法確定的長期穩(wěn)定性期限內(nèi)獲得。3.2色譜條件的優(yōu)化根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn),一些文獻(xiàn)提出了避免ISR失敗,特別是克服基質(zhì)效應(yīng)、防止代謝物干擾的對策,其中以Jemal等提出方案最為系統(tǒng),已經(jīng)被期刊論文引用60余次。其主要內(nèi)容包括:避免血漿磷脂的干擾,充分利用ISR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以及仔細(xì)優(yōu)化色譜條件。為了盡量避免ISR失敗,首先應(yīng)該通過文獻(xiàn)等充分了解待測物的理化性質(zhì)(在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、不同溶劑中的溶解度)、代謝特點(diǎn)(特別關(guān)注是否存在不穩(wěn)定代謝物以及能產(chǎn)生質(zhì)譜檢測干擾的代謝物)、血漿蛋白結(jié)合率、血漿和全血分配比等,將有助于正確選擇生物基質(zhì)、樣品處理和保存條件以及色譜、質(zhì)譜參數(shù)。方法建立后,建議先開展一小規(guī)模的體內(nèi)試驗(yàn),獲得給藥后的試驗(yàn)樣品,將來自不同個(gè)體的試驗(yàn)樣品按照達(dá)峰時(shí)間、消除相分別進(jìn)行混合,獲得具有充足體積的混合試驗(yàn)樣品,進(jìn)行以下試驗(yàn)考察方法的重現(xiàn)性:短期穩(wěn)定性試驗(yàn)(室溫短期放置、多次冷凍-解凍),評價(jià)是否存在不穩(wěn)定代謝物的影響;LC-MS/MS分析時(shí),建議使用多個(gè)SRM離子對,并更換不同的色譜條件考察是否有其他代謝產(chǎn)物或基質(zhì)的影響;采用不同的樣品預(yù)處理方法,考察基質(zhì)的影響;處理后的樣品通過不同比例稀釋后測定,觀察峰面積比的變化,考察基質(zhì)的影響。很多實(shí)例證明,使用空白基質(zhì)進(jìn)行生物分析方法驗(yàn)證,對于方法的可靠性是良好的第一步,但卻不總是反映該方法在分析試驗(yàn)樣品中的表現(xiàn)。生物分析科學(xué)家必須時(shí)刻保持警覺,監(jiān)測分析方法的表現(xiàn)和樣品測試結(jié)果,并且徹底調(diào)查在分析試驗(yàn)樣品中觀察到的任何異?，F(xiàn)象。所有相關(guān)調(diào)查都應(yīng)被完整記錄,并關(guān)注于確定出現(xiàn)問題的根本原因,以便設(shè)計(jì)解決方法。若不能獲得人體樣本,可以先獲得動(dòng)物樣本,為避免代謝上的種屬差異,可以將動(dòng)物的樣本與采用體外實(shí)驗(yàn)獲得的人體代謝物進(jìn)行混合(如人肝微?；蚋渭?xì)胞孵化液)。在建立LC-MS/MS分析方法時(shí),應(yīng)該特別注意容易發(fā)生質(zhì)譜儀源內(nèi)裂解的藥物代謝產(chǎn)物,見表2。必須通過優(yōu)化色譜條件,使藥物與它可能裂解的代謝物實(shí)現(xiàn)完全分離。如果這些代謝物與原形藥物同時(shí)出峰,則可能導(dǎo)致ISR失敗。如果不進(jìn)行色譜分離,除源內(nèi)裂解外,代謝物可能干擾原形藥物質(zhì)譜檢測的情形還有:代謝物前體離子m/z比原形藥物小1或2,代謝物的M+1或M+2(主要為分子結(jié)構(gòu)中含有氯或溴元素)同位素峰有可能對原形藥物的質(zhì)譜檢測產(chǎn)生干擾,如氧化脫胺代謝物(R1R2CHNH2代謝為R1R2CO),氧化脫氫代謝物,醇氧化為醛或酮代謝物,羥基酸類藥物脫水形成內(nèi)酯代謝物的加銨離子等;異構(gòu)體如順反異構(gòu)體、差向異構(gòu)體、手性對映體等;與原形藥物具有相同整數(shù)質(zhì)量的其他代謝物,如醇或酚藥物的磷酸酯前藥,在體內(nèi)很快水解生成醇或酚的母體藥物,后者可繼續(xù)代謝生成硫酸結(jié)合物,將干擾磷酸酯前藥的測定;含有甲醚結(jié)構(gòu)的藥物(RCH2OCH3),可以被氧化代謝為具有相同整數(shù)質(zhì)量的羧酸類代謝物(RCOOH)。采用小規(guī)模臨床先導(dǎo)試驗(yàn)的方法,有時(shí)可以解決高難度的問題。例如,從3名受試者獲得51個(gè)試驗(yàn)樣品,用來支持分析方法開發(fā),從而避免ISR失敗。如果預(yù)期分析