利用prim-er50技術(shù)優(yōu)化球毛殼nd35菌株的rapd分析

利用prim-er50技術(shù)優(yōu)化球毛殼nd35菌株的rapd分析

球毛殼nd35是一種具有優(yōu)勢的陸生真菌。它對番茄灰霉菌、番茄早病菌、黃瓜假病菌和其他致病性菌的生長有不同程度的抑制作用。人工接種也證明了對各種病原體的生防潛力，如楊樹腐敗、蘋果腐敗、番茄腐敗和rizorculari。在溫室和農(nóng)村地區(qū)的生防試驗(yàn)中，對蘋果樹腐敗和其他腐敗病具有良好的抗性。這是一種潛力巨大的抗生菌。為了解球毛殼ND35在植物中的定殖情況,戴楊等利用SCAR標(biāo)記建立了一套檢測體系。本研究利用該體系,結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了更準(zhǔn)確的球毛殼ND35菌株檢測體系,為今后對內(nèi)生真菌球毛殼ND35的定殖情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1內(nèi)生菌球毛殼供試植物:楊樹為1年生107楊樹扦插苗,黃瓜為津研4號(hào)4葉期黃瓜苗。內(nèi)生菌球毛殼ND35菌株,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系資源微生物研究室提供,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上25℃培養(yǎng),4℃冰箱中保存。供試楊樹于扦插第一年根部接種球毛殼ND35菌株。1.2提取各組dna參照CTAB法提取接種植物基因組總DNA。1.3cr引物分析根據(jù)戴楊等的報(bào)道,利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對熒光定量PCR引物,引物序列為ND35-1:5′-GCTCGCAGCTCTGGTGCGGTG-3′,ND35-2:5′-GCCGATTGCCCATGTCCACCTC-3′,引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為156bp。1.4nd33-2的制備25μl反應(yīng)體系為:ddH2O9.5μl,2×SYBRGreenMix12.5μl,引物ND35-1和ND35-2各0.5μl,模板DNA2.0μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2min;94℃變性20s,58℃退火20s,68℃延伸20s,共45個(gè)循環(huán);最后68℃延伸3min。每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束采集熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后先加熱到95℃,然后降至55℃,再緩慢升溫(0.5℃/s)至95℃,記錄熒光信號(hào)的變化,得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。1.5nd35柳樹和黃瓜的生殖器測試1.5.1實(shí)時(shí)熒光定量pcr特性采集不同生長季節(jié)的楊樹組織,提取基因組DNA,利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因設(shè)計(jì)內(nèi)參引物對GAPDH-1、GAPDH-2及特異引物對ND35-1、ND35-2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),分析不同生長季節(jié)間球毛殼ND35菌株的定殖情況。1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測黃瓜生長部位的優(yōu)化在黃瓜根部接種球毛殼ND35,3周后分別采集根、莖、葉部的組織,提取基因組DNA,利用內(nèi)參引物對GAPDH-1、GAPDH-2及特異引物對ND35-1、ND35-2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),分析同一時(shí)間黃瓜不同生長部位球毛殼ND35的定殖情況。2結(jié)果與分析2.1實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系的探索及檢測利用SCAR標(biāo)記獲得的球毛殼ND35特異片段設(shè)計(jì)的一對用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)的引物,以球毛殼ND35基因組DNA為模板,對實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的最佳體系、反應(yīng)程序等進(jìn)行了初步探索,得到了理想的結(jié)果。一般認(rèn)為當(dāng)進(jìn)入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測無效,擴(kuò)增曲線顯示擴(kuò)增Ct值在25～30之間,結(jié)果可信(圖1);熔解曲線顯示擴(kuò)增有單一特異的峰,經(jīng)過凝膠電泳顯示此峰對應(yīng)的片段即為目的片段(圖2)。2.2球毛殼nd33的定殖量利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同生長季節(jié)楊樹根、莖、葉中球毛殼ND35菌株的定殖情況,結(jié)果顯示,六、七、八、九月份楊樹組織中球毛殼ND35的定殖量比較多,其中根部在七月份定殖量最大;莖中球毛殼ND35定殖量在六月份開始增多,七月份達(dá)到高峰,九月份以后逐漸減少;葉中球毛殼ND35定殖量在九月份顯著增多,其它月份基本持平(圖3)。2.3不同組織中球毛殼nd33菌株的分離培養(yǎng)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對溫室中黃瓜苗不同組織中球毛殼ND35菌株進(jìn)行檢測,結(jié)果表明黃瓜苗葉中球毛殼的定殖量最多,根部與莖中定殖量相對較少(圖4)。3生防菌球毛殼的熒光定量pcr檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的檢測方法,與常規(guī)RT-PCR相比具有明顯優(yōu)越的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和操作簡便的特點(diǎn)。近些年來,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于植物營養(yǎng)學(xué)研究、植物發(fā)育學(xué)研究、植物抗逆機(jī)理研究、轉(zhuǎn)基因植物的檢測、植物與微生物互作機(jī)理研究、植物抗病性檢測、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對植物基因表達(dá)的影響等方面。在植物病蟲害研究的許多領(lǐng)域顯現(xiàn)出它的優(yōu)越性,并開始被廣泛應(yīng)用。目前,活體生防木霉的分子檢測技術(shù)已經(jīng)建立,但尚未見國內(nèi)外有應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對生防菌球毛殼進(jìn)行分子檢測的報(bào)道,本文首次報(bào)道了生防菌球毛殼的熒光定量分子檢測技術(shù)。本研究建立并優(yōu)化了利用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測球毛殼ND35菌株定殖情況的體系,可以快速、準(zhǔn)確地檢測ND35菌株的定殖情況,為監(jiān)測生防因子球毛殼ND35在田間的定殖打下了基礎(chǔ)。研究球毛殼ND35菌株的分子標(biāo)記以及在土壤或植物中隨季