解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其抗菌性研究

解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其抗菌性研究

芽桿菌（ba細胞肺癌）具有復雜的生物性特征和底物性多樣性，能夠產(chǎn)生高耐發(fā)芽性芽和各種細菌材料，如多媒體、脂質(zhì)和細菌素類抗生素，這是不同棲息地的重要原因。由非核糖體途徑合成的脂肽類化合物是其中最常見的一類,主要包括Surfactins、Iturins和Fengycins3個家族。由于脂肽類物質(zhì)為親油親水的兩親分子,對其它細菌為非特定作用模式,因此不會產(chǎn)生抗藥性細菌,可作為新一代抗生素,已經(jīng)成為當今研究開發(fā)的熱點。Surfactin是已知最有效的生物表面活性劑之一,可顯著降低水的表面張力(從72mN/m降低到27mN/m),抑制細菌、病毒、真菌、支原體的生長,具有優(yōu)異的乳化和起泡特性,在醫(yī)藥和食品行業(yè)有較高的應用價值;Iturin家族中以IturinA抗真菌活性最強,與常用的化學農(nóng)藥殺菌性能相似,可開發(fā)出有潛力并且環(huán)境安全的生物源農(nóng)藥。而Fengycin對絲狀真菌具有較強的抑制作用。有報道顯示,Surfactin與IturinA共同作用能夠顯著增強抑真菌活性。然而,脂肽及產(chǎn)脂肽細菌在農(nóng)作物土傳病害控制領域的應用仍較少,加強相關(guān)基礎研究十分重要。脂肽類表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選過去主要是根據(jù)菌株在血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血圈的特點進行分離的,但該方法存在較多局限性。本研究結(jié)合多種篩選方法,以獲得產(chǎn)脂肽的目標菌株:(1)通過血平板初篩,排油活性和抗菌性比較等方法從土壤中分離到一組產(chǎn)脂肽菌株;(2)根據(jù)Surfactin代謝過程中的sfp基因(脂肽生物合成必需的第2個基因,編碼的SFP酶屬于4′磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶超家族),以及對IturinA形成起重要作用的ituD基因(編碼丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶,調(diào)控IturinA的產(chǎn)量)和lpa-14基因(編碼4′磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶,調(diào)節(jié)IturinA模板酶復合物的形成)設計引物,對篩選到的菌株進一步進行相關(guān)基因檢測,并結(jié)合FT-IR和HPLC分析其代謝產(chǎn)物,確定脂肽類物質(zhì)類型;(3)對其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)粗提物的乳化性能、表面活性和抑制常見農(nóng)作物病原菌生長的特性進行了相應的研究,為認識產(chǎn)脂肽菌株在農(nóng)業(yè)領域的應用潛力和開發(fā)利用該菌株及相關(guān)微生物資源提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1土壤：用于分離抗感菌的土壤為江蘇省宜興市蘆平村采集的花園土壤1.1.2固體有機廢棄物試驗所用香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,FOC)、棉花黃萎病病原菌(Verticilliumdahliae,Vd)、黃瓜立枯病病原菌(Rhizoctoniasolani,Rhs)、煙草黑脛病病原菌(Phytophthoraparasitica,Php)和番茄青枯病病原菌(Ralstoniasolanacearum,Rs)全部由江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室提供。1.1.3發(fā)酵乳的制備PDA:馬鈴薯200,葡萄糖20瓊脂2%;LB:蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,pH7.0;NA:葡萄糖10,蛋白胨5,牛肉膏3,pH7.0-7.2;Landy:葡萄糖20,L-谷氨酸鈉5,KH2SO41MgSO40.5,KCl0.5,酵母粉1,L-苯丙氨酸2×10-3MnSO45×10-3,CuSO40.16×10-3,FeSO40.15×10-3pH7.0。血瓊脂平板購自上海科瑪嘉生物技術(shù)有限公司。固體培養(yǎng)基為相應液體培養(yǎng)基添加2%(W/V)瓊脂制得。1.1.4標準品：從西格瑪購買標準產(chǎn)品和用品1.2選擇和鑒定細菌1.2.1菌株的培養(yǎng)和活性取采集到的番茄根際土壤10g放入90mL無菌水中,振蕩混勻,80°C水浴20min,冷卻至室溫,稀釋成10-5、10-6梯度后涂布于血瓊脂平板,放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2d,選取產(chǎn)生明顯溶血圈的菌株劃線于固體LB培養(yǎng)基上,37°C培養(yǎng)1d,保存?zhèn)溆谩?.2.2菌株的培養(yǎng)和除菌將初篩得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,30°C、170r/min搖床培養(yǎng)48h,10000r/min離心15min去除菌體,發(fā)酵上清液過0.22μm孔徑濾膜除菌,4°C保存。1.2.3半干油膜的制備取一直徑9cm培養(yǎng)皿,加入無菌水,再加入0.1mL液體石蠟使之在水面形成油膜,然后在油膜中心加入0.01mL發(fā)酵上清液,中心油膜會被擠向四周形成一個圓圈,圈的大小與表面活性劑的含量呈正比,每個處理重復3次。1.2.4抑菌帶大小的檢測用直徑5mm的打孔器切取病原真菌菌餅(立枯絲核菌取菌核)置于PDA平板中央,在四周用滅菌牙簽點接所試菌株,平板于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d,觀察菌株對不同病原真菌的抑菌效果,測量抑菌帶大小。菌株對青枯菌的抑菌效果采取在固體NA培養(yǎng)基上點接功能菌(30°C先培養(yǎng)12-16h),然后噴灑106-107CFU/mL的青枯菌菌懸液,30°C培養(yǎng)箱內(nèi)放置1-2d,測量抑菌圈大小,比較各菌株的拮抗性能差異。1.2.5itud和lpa-14使用柱式DNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)提取各功能菌株總DNA,擴增引物序列見表1。PCR采用25μL體系,以菌株DNA基因組為模板,反應條件:擴增sfp為:94°C5min;94°C1min,48°C30s,72°C1min,30個循環(huán);72°C10min;檢測ituD和lpa-14為:94°C5min;94°C1min,58°C30s,72°C1.5min,30個循環(huán);72°C10min。目的片段經(jīng)試劑盒(AxyprepDNAGelExtractionKit,AxygenBiosciences)純化后連接到PMD19-T-vector(TaKaRa)上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,隨機挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒并酶切驗證,序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.2.6pcr擴增生理生化性質(zhì)測定方法參見文獻,擴增引物采用16SrDNA通用引物(16s-f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;16s-r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。PCR采用25μL反應體系,以菌株DNA為模板進行擴增,反應條件:94°C5min;94°C30s,50°C30s,72°C1min,30個循環(huán);72°C10min。PCR產(chǎn)物采用試劑盒(AxyprepDNAGelExtractionKit,AxygenBiosciences)純化后,連接到PMD19-T-vector(TaKaRa)上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證后,交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成測序工作。測序結(jié)果在RDP數(shù)據(jù)庫中進行比對,選取同源性較高的序列采用MEGA3.1軟件分析菌株同源性,鄰近法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。1.3脂肪醇的定性分析1.3.1表面活性劑的制備將菌株XZ-173接種于發(fā)酵培養(yǎng)基Landy中,30°C、170r/min搖床培養(yǎng)2d,取一定量發(fā)酵液,10000r/min離心15min去除菌體,上清液用6mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至2.0,出現(xiàn)白色絮狀沉淀,4°C靜置過夜,再以10000r/min離心20min收集沉淀;用pH2.0的HCl洗滌3次將沉淀溶于無菌水中,用NaOH調(diào)pH至7.0,冷凍干燥得表面活性劑粗品。將表面活性劑粗品用KBr壓片,采用ThermoFisherIS10紅外光譜儀分析樣品組成。1.3.2流動相及溫度HPLC分析系統(tǒng)為AgilentHPLC1200series,色譜柱為ZORBAXEclipseXDB-C18AnalyticalColumn(5μm,4.6nm×250nm);檢測波長為280nm,柱溫為30°C;采用等梯度洗脫進行樣品分析,所用流動相A為乙腈,流動相B為0.1%三氟乙酸(V/V),流動相比例:Surfactin分析為A:B=70:30(V/V);IturinA分析為A:B=40:60(V/V);流速:1.0mL/min;進樣量:10μL。1.4關(guān)于脂肪表面活性劑的一般性質(zhì)的研究1.4.1乳化穩(wěn)定性測定準確稱取20mg脂肽粗品溶于20mL無菌水中,混勻,稀釋不同梯度,制成1000、500、200、100、50和20mg/L的粗脂肽溶液。乳化指數(shù)(EI24)=乳化層高度/溶液總高度×100%。乳化液放置96h,每隔24h測量乳化指數(shù),依下式比較不同濃度粗脂肽溶液的乳化穩(wěn)定性:乳化穩(wěn)定性(Stability)=EIt/EI0×100%。EI0為靜置0h溶液的乳化指數(shù),EIt為溶液靜置th的乳化指數(shù)。1.4.3表面張力的測定粗脂肽排油能力的測定方法參照1.2.3;表面張力的測定采用環(huán)法,儀器為ZL-2型自動界面張力儀(山東淄博博山同業(yè)分析儀器廠),每個樣品重復測3次。2結(jié)果與分析2.1菌株的質(zhì)的能力番茄根際土壤經(jīng)過血平板初篩,分離到溶血效果明顯的8株菌株,通過排油和抑菌試驗比較各菌株產(chǎn)表面活性劑和抑菌物質(zhì)的能力,從表2結(jié)果可知,菌株Z-25具有較強的排油活性,卻無抑菌性;菌株Z-62、Z-72、Z-92、Z-101、XZ-173排油活性雖不如Z-25,但對所試植物病原菌均有較好的抑菌效果,其中以Z-62和XZ-173抑菌性最好,綜合菌株產(chǎn)表面活性劑和抑菌物質(zhì)能力考慮,挑取菌株Z-25、Z-62、XZ-173做后續(xù)試驗。2.2電泳檢測結(jié)果分別以初篩細菌基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴增,發(fā)現(xiàn)只有菌株XZ-173能夠同時擴增出大小約為675、1203和675bp的特異性條帶(圖1),電泳檢測與陽性對照菌株(FZB42)結(jié)果一致,初步確認為sfp、ituD和lpa-14基因。PCR產(chǎn)物純化后連接到克隆載體測序,所得序列與BLAST公布的sfp、ituD和lpa-14基因同源性高達99%以上,確定XZ-173具有sfp、ituD和lpa-143個基因。2.3多聚糖質(zhì)糖系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建菌株XZ-173革蘭氏染色陽性,細胞為桿狀,過氧化氫酶陽性、淀粉水解陽性、V.P.反應陰性、甲基紅試驗陽性、明膠水解陽性、硝酸鹽還原陽性、吲哚試驗陰性,能利用檸檬酸鹽、酒石酸鹽,能產(chǎn)氨,發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖只產(chǎn)酸。將XZ-173的16SrDNA序列提交至RDP數(shù)據(jù)庫中進行比對分析,選取同源性較高的20條16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明,菌株XZ-173與B.amyloliquefaciens標準菌株CR-502(GenBank登錄號AY603658)同源性最高(98.5%),再結(jié)合生理生化特性,初步判定菌株XZ-173為解淀粉芽孢桿菌。2.4脂肽產(chǎn)物的測定結(jié)果菌株XZ-173的表面活性劑粗品產(chǎn)率為1.1g/L,取適量樣品進行FT-IR分析,結(jié)果如圖3所示,在IR圖譜上,3411.37cm-1是由分子鏈間氫鍵引起的NH伸縮譜帶,1649.76cm-1和1551.66cm-1分別為酰胺譜帶Ⅰ和Ⅱ,這些特征吸收表明樣品中含有肽鏈。譜圖上2960-2860cm-1和1455-1380cm-1兩處吸收是脂肪酸鏈的C-H伸縮振動,1236.02cm-1為內(nèi)酯的特征吸收,表明樣品含有脂肪酸分子,從而證明該樣品為脂肽類物質(zhì)。對提取的脂肽樣品經(jīng)CH3OH萃取后經(jīng)HPLC與標準品進行比對。由圖4A可見,Surfactin標準品在保留時間3.065、3.529、4.098min出現(xiàn)特征峰(經(jīng)LC-MS確定),而脂肽樣品在保留時間3.129、3.484min兩處出現(xiàn)了吸收峰(圖4B),這2個峰位于標準峰附近,推測可能是Surfactin的同系物,故樣品含有Surfactin。比較圖5A和圖5B可知,IturinA標準品的特征峰在保留時間3.260、6.665、8.809、9.266min出現(xiàn),脂肽樣品在保留時間3.252、6.666、8.731、9.344min也各有4個峰,這些峰均在標準峰附近,因此樣品同樣含有IturinA。采用HPLC對脂肽粗品中Surfactin和IturinA的含量進行測定,測得XZ-173的Surfactin和IturinA的產(chǎn)量分別為158.90和75.09mg/L,其Surfactin產(chǎn)量高于B.subtilisATCC21332(109.50mg/L),在已報道的文獻中是較高的。Note:Bootstrapvalues(%)from1000replicatesareasshown.Thescalebarrepresents0.005nucleotidesubstitutionsperposition.NumbersinbracketsareGenBankaccessionnumbersforthe16SrDNAgenesequenceofthetypestrains.2.5粗脂肽溶液的乳化性能將粗脂肽溶液稀釋成不同濃度,分別與煤油振蕩混勻,靜置,測得乳化指數(shù)(圖6)和乳化液穩(wěn)定性(圖7)。粗脂肽溶液濃度越高,乳化能力越強(圖6)。粗脂肽濃度在高于500mg/L時,EI24達70%以上,表現(xiàn)出良好的乳化性能,但是乳化能力隨著溶液濃度的增加變化不顯著;在濃度低于500mg/L時,EI24隨著粗脂肽濃度的降低下降明顯,且濃度低于50mg/L的粗脂肽溶液已經(jīng)沒有任何乳化能力。根據(jù)圖7結(jié)果可知,乳化液放置96h,不同濃度粗脂肽溶液的乳化穩(wěn)定性均有一定程度的下降,在濃度高于500mg/L時,穩(wěn)定性僅下降10%左右,乳化穩(wěn)定性能較好;粗脂肽濃度越低,乳化液穩(wěn)定性越差,隨著靜置時間的增加,降低也越顯著。由此可見,粗脂肽溶液具有一定的乳化活性,需做進一步的提純研究。溶液排油圈大小與表面張力值呈負相關(guān)。由圖8可知,隨著粗脂肽濃度的降低,溶液的排油能力逐漸減弱,相應的表面張力值逐漸增加,當濃度達到500mg/L以上時,表面張力值降至26.6mN/m后基本保持不變;當濃度低于20mg/L時,粗脂肽溶液排油圈直徑(10.7mm)與對照(10mm)差異不顯著表面張力值為66.5mN/m,幾乎沒有表面活性。經(jīng)計算所提取的脂肽類表面活性劑粗品CMC值約為500mg/L,比一般的化學表面活性劑的CMC值(SDS2120mg/L和吐溫20600mg/L)要低,顯示出脂肽作為生物表面活性劑的優(yōu)越性能。2.6粗脂肽溶液抑菌效果由于菌株對青枯菌和立枯絲核菌拮抗效果明顯,故選取這兩種病原菌作為指示菌,研究了不同濃度粗脂肽溶液的抑菌活性(表3)。高濃度的粗脂肽溶液(1000mg/L)對立枯絲核菌和青枯菌都表現(xiàn)出明顯的抑制效果,抑菌圈直徑分別為16.27mm和14.43mm。隨著濃度的降低,拮抗活性逐漸減弱,在200mg/L時粗脂肽對立枯絲核菌已經(jīng)沒有抑菌活性,但對青枯菌仍具有一定的抑菌作用,說明所提取的脂肽類物質(zhì)對細菌病害的防治效果要好于真菌,具有一定的開發(fā)潛力,對其中的抑菌組分需做更深入的分離研究。3菌株xr-17的應用本研究通過采用溶血圈、排油圈、抑菌性試驗與PCR相結(jié)合的方法,從宏觀表面活性,抗真菌性和微觀分子基因的角度篩選產(chǎn)脂肽類物質(zhì)Surfactin和IturinA菌株,彌補了單純用溶血圈進行菌株篩選的不足;利用紅外光譜(FT-IR)高效液相色譜(HPLC)鑒定產(chǎn)物,建立了較為完整的篩選體系。并對脂肽類產(chǎn)物粗提物的表面活性和抗菌特性進行了研究,為產(chǎn)脂肽菌株Bacillusamylol