高等植物脂氧合酶活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

高等植物脂氧合酶活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

0lox活性物質(zhì)高等植物脂氧合酶（lee1.13.11.12）是一種含有非血紅素鐵的氧合酶（oxygense）。酶蛋白（apollol）由多條多酚鏈組成，金屬離子輔助組的激活狀態(tài)為fe3+，非激活狀態(tài)為fe2+。LOX專一催化具1,4-順-順-戊二烯結(jié)構(gòu)(cis,cis-1,4-pentadienemoieties)的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFA)的加氧反應(yīng),生成不飽和脂肪酸的氫過氧化物(hydroperoxide)。LOX的一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)決定了其催化專一性及產(chǎn)物的類型;植物L(fēng)OX第570—580位氨基酸殘基組建的模體(motif)決定其催化位點(diǎn)是C9-位還是Cl3-位,具蘇氨酸-纈氨酸(threonine-valinemotif,TV)模體的LOX表現(xiàn)為9-LOX活性,具蘇氨酸-苯丙氨酸(threonine-phenylalanine,TF)模體或其他結(jié)構(gòu)的LOX表現(xiàn)為13-LOX活性。LOX的植物亞細(xì)胞定位具有多樣性。葉綠體(chloroplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(pusule)、微體(microbody)、脂質(zhì)體(liposome)、質(zhì)膜(plasmamembrane)及胞漿(cytoplasmicmatrix)都曾發(fā)現(xiàn)LOX的存在,如黃瓜(Cucumissativus)LOX既以可溶性的形式存在于胞漿和液泡中,也可以以跨膜蛋白(transmembraneprotein)的形式存在于脂質(zhì)體膜(liposomemembrane)和質(zhì)膜(plasmamembrane)上。LOX有多種生理功能。(1)合成活性物質(zhì)。LOX催化反應(yīng)的初產(chǎn)物脂肪酸氫過氧化物存在2條代謝途徑,一條最后形成創(chuàng)傷激素(traumatin),該物質(zhì)參與植物對(duì)傷害的反應(yīng),另一條的終產(chǎn)物為茉莉酸(jasmonicacid,JA),JA及其甲酯對(duì)植物的種子萌發(fā)、生長及抗逆反應(yīng)等起重要的信號(hào)作用。(2)參與植物衰老。LOX催化脂質(zhì)過氧化(lipidperoxidation)過程中,有一個(gè)產(chǎn)生自由基(freeradical)的階段,自由基和氫過氧化物能增加膜透性而加速細(xì)胞衰老。(3)參與烤煙(Nicotianatabacum)等農(nóng)產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味、香味物質(zhì)的形成。LOX催化生成的氫過氧化物可進(jìn)一步降解成小分子醛(aldehyde)、醇(alcohol)等揮發(fā)性物質(zhì),該過程既是豆制品產(chǎn)生腥味的原因,也是某些農(nóng)產(chǎn)品風(fēng)味及香味物質(zhì)的來源,如LOX催化亞油酸(linoleicacid)、亞麻酸(linolenicacid)氧化形成的己烯醇(hexenol)、己烯醛(hexenal)等可使烤煙(N.tabacum)、豌豆(Pisumsativum)、大豆(Glycinemax)等具備特殊香味。LOX影響植物的生長、發(fā)育、衰老及抗逆反應(yīng),并在烤煙(N.tabacum)等農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用,所以,快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏地測(cè)定LOX活性至關(guān)重要。2005年,梅伏生等總結(jié)了部分LOX活性檢測(cè)方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn);2007年,劉淵等比較了LOX活性檢測(cè)部分方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。本文進(jìn)一步系統(tǒng)概括了高等植物L(fēng)OX活性測(cè)定方法的研究進(jìn)展,旨在為特定高等植物L(fēng)OX活性的高效、準(zhǔn)確測(cè)定提供參考。1通過lox促進(jìn)反應(yīng)中氫氧化的生成速度來測(cè)量參數(shù)1.1lox活性的變化自1932年LOX被首次報(bào)道以來,基于對(duì)LOX底物屬性的知識(shí),最早于1940年出現(xiàn)的LOX活性測(cè)定方法為胡蘿卜素脫色(漂白)(carotenebleaching,CB)法(表1)。該法原理為:LOX催化產(chǎn)生的過氧化氫基可與β-胡蘿卜素反應(yīng)產(chǎn)生無色的β-胡蘿卜素環(huán)氧化物(epoxides),故檢測(cè)反應(yīng)液在452nm吸光值的變化即可推算LOX活性。1940年,SUMNER等用該法以胡蘿卜素的褪色速度測(cè)定了大豆(G.max)LOX粗酶液的活性。但是,因胡蘿卜素在水溶液中的溶解度較低而限制了此法的運(yùn)用。1971年,AZIZ等通過用Tween-80對(duì)亞油酸鹽和胡蘿卜素進(jìn)行乳化而解決了胡蘿卜素在水溶液中的溶解度低的問題,大大提高了CB法的實(shí)用性。后來,KIKUCHI等用此法檢測(cè)了大豆(G.max)的LOX活性,并建立了篩選大豆(G.max)子葉(cotyledon)LOX基因(LOX)缺失突變體的胡蘿卜素漂白比色法,該法后來被用于耐儲(chǔ)藏水稻(Oryzasativa)品種的快速篩選。CB法的優(yōu)點(diǎn)是,因所用底物在不同pH范圍內(nèi)都有很好的溶解性,故可用于探索pH對(duì)特定植物L(fēng)OX活性的影響。但是,LOX不同同工酶(isoenzyme)的氧化能力差異和有限的靈敏度均使CB法應(yīng)用受限,如LOX-1僅在低氧或無氧條件下有活性,LOX-2卻在任何條件下活性都很低;目前,該法主要用作精確度要求不是特別高的LOX活性的快速測(cè)定。1.2lox-2活性的檢測(cè)Fe(CNS)3顯色法在CB法后問世(表1),其原理為:LOX催化產(chǎn)生的過氧化氫基能氧化Fe(CNS)2生成有色化合物,故可通過比色法檢測(cè)LOX活性。1943年,BALLS等用此法檢測(cè)了大豆(G.max)LOX粗酶液和經(jīng)初步純化酶液的活性;1958年,KOCH等用此法研究了底物對(duì)LOX活性檢測(cè)效果的影響;2004年,KIM等用此法檢測(cè)到脫腥大豆(G.max)種子LOX-2的存在。Fe(CNS)3顯色法有簡便、可連續(xù)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),但是,該法中生成的有色物質(zhì)不是很穩(wěn)定,且有色物質(zhì)的吸光值與Fe(CNS)3量間缺乏良好的線性關(guān)系,因此,近年此法常用于LOX同工酶的定性檢測(cè)、LOX同工酶缺失突變體篩選等。1.3lox-射線氧合酶活性的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)分光光度法(standardspectrophotometricmethod)即大部分文獻(xiàn)所述的分光光度法于1946年問世(表1),其原理為:具共軛雙鍵(conjugateddoublebond)的氫過氧化物在234nm處有特征吸收峰,故通過測(cè)定反應(yīng)體系在該處的吸光值可檢測(cè)共軛二烯(conjugateddienes)的生成量、進(jìn)而推算LOX酶活性。該法自1946年問世以來,SURREY和AXELROD等分別對(duì)該法在反應(yīng)條件等方面做了重大改進(jìn),該法現(xiàn)已成為實(shí)驗(yàn)室LOX活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。標(biāo)準(zhǔn)分光光度法也有快速、簡便和易于連續(xù)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn),故應(yīng)用廣泛。但在測(cè)定過程要嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間,并保持反應(yīng)體系均相(homogeneousphase),該法不適于濁度(turbidity)較高的LOX粗酶液活性的測(cè)定。1.42lox活性的測(cè)定2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituricacid,TBA)顯色法于1966年問世(表1),其原理為:氫過氧化物能與TBA結(jié)合、生成黃或紅色加合物(bulkyadducts),故通過檢測(cè)反應(yīng)體系在480nm處吸光值變化可推算LOX活性。1966年,RHEE和WATTS用此法測(cè)定了植物根(root)、塊莖(stemtuber)等器官的脂質(zhì)氧化電位(lipidoxidationpotential),以反映LOX活性;同年,RHEE等又將該法成功用于冷凍蔬菜LOX活性的檢測(cè)。2-硫代巴比妥酸顯色法具有可連續(xù)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn),但易受Fe2+、Fe3+、Cu2+等離子的干擾;該法現(xiàn)主要用于食品如冷凍蔬菜、脫脂豆粉(defattedsoybeanflour)LOX活性的檢測(cè),并被作為食品儲(chǔ)藏中質(zhì)量控制的重要方法之一。1.5間接測(cè)定lox活性碘化鉀-淀粉(potassiumiodide-starch,KI-S)法問世于1986年(表1),其原理為:氫過氧化物在酸性條件下氧化I-形成I2,后者與淀粉結(jié)合顯色、在470nm處的吸光值與生成的I2量呈線性相關(guān),因而可間接測(cè)定LOX活性。1986年,WILLIAMS等用此法檢測(cè)了沒有燙漂過的水果、蔬菜的LOX活性,但沒有在含類胡蘿卜素(carotinoid)的樣品中檢測(cè)到LOX活性;2009年,IASSONOVA等用此法檢測(cè)了去LOX大豆(G.max)殘留LOX-1的活性。碘化鉀-淀粉法符合食品加工中快速、簡單測(cè)定LOX活性的要求,并因測(cè)定體系具備肉眼可辨的特征顏色而特別適于LOX的定性分析。但該法靈敏度較低,且不適用于檢測(cè)胡蘿卜(Daucuscarota)和番茄(Lycopersiconesculentum)等色素含量較高蔬菜的LOX活性。此外,該法操作中反應(yīng)試劑極易氧化而造成干擾,故必須嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。1.6lox活性的檢測(cè)二甲苯酚橙法(ferrousoxidation-xylenolorangemethod,FOX)問世于1995年(表1),其原理為:氫過氧化物可將Fe2+氧化為Fe3+,后者與二甲苯酚橙鹽形成的二甲苯酚橙-鐵(Ⅲ)(ferric-xylenolorange,XO/Fe3+)絡(luò)合物在560nm處有特征吸收峰,故據(jù)反應(yīng)體系在560nm處吸光值的變化可推算LOX活性。1995年,WASLIDGE等分析了FOX法的特性,認(rèn)為該法適用于多種LOX活性的檢測(cè);2005年,VEGA等從“醇水比(methanol/waterratio)”、溶劑“除氣率(degassingratio)”等方面對(duì)該法進(jìn)行優(yōu)化后成功用于大豆(G.max)LOX活性的檢測(cè);2009年,FUKUZAWA等進(jìn)一步改進(jìn)該法,即通過加入膜狀磷脂酰膽堿(phosphatidyl-choline,PC)、形成高鐵二甲苯酚橙-PC(ferric-xylenolorange-PC,XO/Fe3+-PC)絡(luò)合物,該物質(zhì)在610nm處有最大吸收而大大提高了二甲苯酚橙法的靈敏性。FOX法具方便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),且生成的有色物很穩(wěn)定,特別適用于LOX活性抑制劑的高通量篩選。2通過lox促進(jìn)中低產(chǎn)量反應(yīng)的溶脹率來測(cè)量參數(shù)2.1lox活性的檢測(cè)量壓法(manometricmethod)也叫Warburg呼吸儀法,問世于1944年(表1),其原理為:LOX催化的反應(yīng)耗氧,使一定體積的密閉體系內(nèi)的O2量減少、恒溫條件下體系的氣體總壓下降,故據(jù)密閉體系的氣體壓力變化值、用氣體方程可計(jì)算出反應(yīng)的耗氧量,進(jìn)而推算LOX活性。1944年,THEORELL等發(fā)現(xiàn),此法檢測(cè)LOX活性的過程中O2吸收量與LOX活性間不具備良好的比例關(guān)系;但SHASTRY等于1975年、倪培德等于1991年分別報(bào)道了用該法檢LOX活性取得了較好效果;2000年,該法檢測(cè)硬粒小麥(Triticumaestivum)LOX活性的過程得到了詳細(xì)描述。量壓法的優(yōu)點(diǎn)在于,因測(cè)定參數(shù)與反應(yīng)體系濁度無關(guān),故既適用于LOX純酶也適用于LOX粗酶活性的檢測(cè)。但該法檢測(cè)過程耗時(shí)長達(dá)30min以上,非LOX催化的耗氧反應(yīng),如脂肪酸的α-氧化、粗提物中非脂類物質(zhì)的氧化等,均對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大;此外,運(yùn)用該法必須嚴(yán)格保持體系密閉恒溫。2.2lox活性的檢測(cè)氧電極法(oxygenelectrodemethod)問世于1967年(表1),其原理為:底物濃度一定時(shí),在一定時(shí)間內(nèi),反應(yīng)溶液里O2濃度減少的速率與LOX活性成正比,故通過用氧電極測(cè)定O2的濃度變化可推算LOX活性。1967年,MITSUDA等用該法檢測(cè)大豆(G.max)的LOX活性;1979年,GROSSMAN等對(duì)該法進(jìn)行改進(jìn),使之成為實(shí)驗(yàn)室中LOX活性的另一標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法,現(xiàn)已廣泛用于精密度較高的LOX活性檢測(cè)中。此外,基于該法的集數(shù)據(jù)處理和LOX活性檢測(cè)于一身的、適應(yīng)工廠化生產(chǎn)的臺(tái)式設(shè)備研制也取得初步進(jìn)展。氧電極法的優(yōu)點(diǎn)是可連續(xù)記錄反應(yīng)進(jìn)程、靈敏度高,且不受反應(yīng)體系濁度的影響,特別適用于LOX純酶和粗酶的動(dòng)力學(xué)(kinetics)研究。但是,該法在測(cè)定操作中需嚴(yán)格控制反應(yīng)系統(tǒng)的溫度和氣密性,對(duì)儀器要求較高,這在一定程度上影響了此法在一般試驗(yàn)和生產(chǎn)中的應(yīng)用。2.3lox活性的檢測(cè)亞甲基藍(lán)染色(漂白)法(methylenebluebleachingmethod,MBB)問世于1992年(表1),其原理為:亞甲基藍(lán)作為氧化還原指示劑在溶液中的褪色速度與LOX催化反應(yīng)體系氧化還原電位(oxidation-reductionpotential,ORP)的變化速度在一定時(shí)間內(nèi)呈線性關(guān)系,而ORP的下降速度又取決于LOX活性,故通過測(cè)定反應(yīng)體系在660nm處的吸光值變化可衡量體系中亞甲基藍(lán)的褪色速度,進(jìn)而推算LOX活性。1992年,TOYOSAKI首先提出亞甲基藍(lán)可作為LOX活性的指示劑。目前,該法已成功用于甜玉米(sweetcorn)等植物材料在燙漂過程中LOX滅活效果的追蹤、LOX同工酶活性的分別檢測(cè)。亞甲基藍(lán)染色法簡單、快速、靈敏度高,可分別測(cè)定LOX-1和LOX-2活性,故適用于LOX同工酶活性的大規(guī)模檢測(cè)。3其他方法包括檢測(cè)洛氏活性3.1lox-1和lox-3活性的檢測(cè)酶聯(lián)免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于檢測(cè)LOX活性最早始于1982年(表1),YABUUCHI等發(fā)現(xiàn)LOX-1活性與通過ELISA測(cè)得的酶蛋白濃度具有一定線性關(guān)系,于是通過親和色譜法(affinitychromatography)純化LOX-1和LOX-3作為抗原(antigen),經(jīng)免疫獲得抗血清(antiserum),并利用ELISA定量檢測(cè)LOX-1和LOX-3活性;1993年,DROILLARD等用此法檢測(cè)LOX含量,發(fā)現(xiàn)在番茄(L.esculentum)果實(shí)由綠變紅的過程中,LOX活性與含量的比值逐漸下降。近年來,此法主要用于LOX同工酶類型的篩選及酶的定位分析。3.2lox超弱光照變化超弱發(fā)光發(fā)射光譜法(superweakluminescenceemissionspectrumassay)用于檢測(cè)LOX活性最早始于1982年(表1)。超弱發(fā)光又稱低水平化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence,CL)是生物體普遍存在的現(xiàn)象。對(duì)于植物,LOX對(duì)亞油酸的催化是超弱發(fā)光的重要來源,故通過測(cè)定植物體的超弱發(fā)光變化可推算LOX活性。1982年,LILIUS等通過偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光探針(chemiluminescentprobe)即發(fā)光氨(luminol,又稱氨基苯二酰一肼)與LOX催化的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)放大了CL信號(hào),借此建立了基于CL的LOX檢測(cè)方法,但發(fā)光氨提高以CL檢測(cè)LOX活性的靈敏度的作用直至1999年才被進(jìn)一步證實(shí)。1992年,KONDO等用CL-HPLC系統(tǒng)檢測(cè)被真菌(fungus)侵染后大豆(G.max)苗期LOX活性的變化。1997年,蘇震等通過生物體系超弱發(fā)光動(dòng)力學(xué)分析研究了LOX缺失體大豆(G.max)苗期子葉(cotyledon)和真葉(euphylla)的超弱發(fā)光變化,為直接鑒定植物活體材料的LOX同工酶缺失體奠定了基礎(chǔ)。超弱發(fā)光發(fā)射光譜法優(yōu)點(diǎn)在于可對(duì)植物活體材料直接進(jìn)行LO