含乳飲料及其乳原料中酪蛋白含量的測(cè)定(BJS201915)

含乳飲料及其乳原料中酪蛋白含量的測(cè)定

BJS2019151范圍本方法規(guī)定了含乳飲料及其原料中酪蛋白四種亞型asi-酪蛋白、as2-酪蛋白、B-酪蛋白、k-酪蛋白含量測(cè)定的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含乳飲料及其原料中酪蛋白總含量的測(cè)定，不適用于發(fā)酵法、酶解法、水解法等工藝對(duì)蛋白質(zhì)改性的樣品。2原理試樣溶液中的酪蛋白采用等電點(diǎn)沉淀后復(fù)溶，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，同時(shí)加入同位素內(nèi)標(biāo)，C18水相柱分離，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。3試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑濃鹽酸(HC1)。甲酸(CH2O2)：質(zhì)譜級(jí)。醋酸(CH3COOH)：色譜級(jí)。孝典善膏白=C&Mt熨xflxf2xf3錯(cuò)誤!未找到引用源。錯(cuò)誤!未找到引用源。錯(cuò)誤!未找到引用源。（10mL）；錯(cuò)誤!未找到引用源。錯(cuò)誤!未找到引用源。錯(cuò)誤!未找到引用源。（10mL）；錯(cuò)誤!未找到引用源。（步驟5.1中）從溶解的試樣中抽取用于式中:錯(cuò)誤!未找到引用源。 一（步驟5.1中）50mL試樣溶解液中各酪蛋白亞型的蛋白濃度aSl-、aS2->[3-、K-,單位為pmol/L;錯(cuò)誤!未找到引用源。 一經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算后各酪蛋白亞型的肽段濃度，即代表各酪蛋白亞型蛋白濃度，單位為|imol/L；—（步驟5.5中）試樣酶解后的定容體積，單位為mL（1mL）；—（步驟5.5中）試樣稀釋液的酶解體積，單位為mL（0.2mL）；（步驟5.2中）復(fù)溶試樣中沉淀蛋白的溶液體積，單位為mL沉淀蛋白的溶解液體積，單位為mL（10mL）；錯(cuò)誤!未找到引用源。—（步驟5.3中）Bradford或BCA法測(cè)定后，稀釋復(fù)溶錯(cuò)誤!未找到引用源。蛋白溶液的稀釋因子。試樣溶液中各酪蛋白亞型的含量計(jì)算試樣中各酪蛋白亞型的含量按式（2）計(jì)算：Xi=錯(cuò)誤!未找到引用源。（2）式中：Xi—試樣中各酪蛋白亞型的含量aSl-、aS2-、供、K-,單位為g/100g或g/100mL；錯(cuò)誤!未找到引用源。一（公式1中）試樣溶解液中的各酪蛋白亞型濃度aSl-、aS2-、。-、K-,單位為|imol/L;M一aSl->aS2->0-、k-酪蛋白的相對(duì)分子量（附錄A表A.2）,單位為g/mol;錯(cuò)誤!未找到引用源。一溶解樣品的溶液體積，單位為mL（50mL）；m 一試樣質(zhì)量或體積，單位為g或者mL。注：試樣中各酪蛋白亞型的含量需按照附錄A表A.2中的蛋白分子量計(jì)算。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字?？偫业鞍缀坑?jì)算試樣中酪蛋白總含量按式（3）計(jì)算：A=錯(cuò)誤!未找到引用源。⑶A—試樣中各種酪蛋白亞型含量的總和，即試樣中酪蛋白的總含量，單位為g/100g或g/100mL；錯(cuò)誤!未找到引用源。一試樣中aSl-型酪蛋白的含量，單位為g/100g或g/100mL；錯(cuò)誤!未找到引用源。 一試樣中aS2-型酪蛋白的含量，單位為g/100g或g/100mL；錯(cuò)誤!未找到引用源。 一試樣中供型酪蛋白的含量，單位為g/100g或g/100mL；錯(cuò)誤!未找到引用源。 一試樣中K-型酪蛋白的含量，單位為g/100g或g/100mL。7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%o8其他本方法的特征肽段、粉狀及液體含乳飲料、粉狀及液體乳原料的檢出限與定量限如下表4所示:表4儀器、方法檢出限及定量限特征肽段儀器LOD/LOQasi-型酪蛋白nmol/Las2一型酪蛋白nmol/Lp-型酪蛋白nmol/LK.型酪蛋白nmol/L檢出限LOD1111定量限LOQ3333粉末狀含乳飲料方法LOD/LOQ（以5g試樣稱取，50mL溶液定容計(jì)算）asi-型酪蛋白%/g（XS2-型酪蛋白Ng/gP-型酪蛋白膽gK-型酪蛋白Hg/g檢出限LOD0.250.260.250.21定量限LOQ0.740.780.750.64液體狀含乳飲料方法LOD/LOQ（以10mL試樣量取，50mL溶液定容計(jì)算）asi-型酪蛋白gg/mLas2-型酪蛋白gg/mLB-型酪蛋白pg/mLK-型酪蛋白|ig/mL檢出限LOD0.120.130.130.11定量限LOQ0.370.390.380.32粉末狀乳原料方法LOD/LOQ（以1g試樣稱取，50mL溶液定容計(jì)算）as「型酪蛋白Ftg/gas?-型酪蛋白咽g佚型酪蛋白四g/gK-型酪蛋白咽g檢出限LOD1.21.31.31.1定量限LOQ3.73.93.83.2液體乳原料方法LOD/LOQ（以2mL試樣量取，50mL溶液定容計(jì)算）as「型酪蛋白四g/mLas?-型酪蛋白gg/mLB-型酪蛋白|ig/mLK-型酪蛋白|ig/mL檢出限LOD0.610.650.630.53定量限LOQ1.82.01.91.6本方法的準(zhǔn)確度如下表5所示:酪蛋白加標(biāo)水平（gmol/L）回收率（％）精密度（％）0.0171.07.70.0571.65.50.164.34.50.570.75.2264.75.9556.65.8附錄A表A.1酪蛋白肽段標(biāo)準(zhǔn)品信息序號(hào)名稱肽段序列相對(duì)分子量Mw（g/mol）1asi-酪蛋白YLGYLEQLLR1267.52asi-酪蛋白（內(nèi)標(biāo)）PSERYLGYL*(與小)EQLLRLKKY2276.63as2-酪蛋白FALPQYLK979.24as?-酪蛋白（內(nèi)標(biāo)）RY0KFALP0YL*("不)KTVY02053.35供酪蛋白VLPVPQK780.06性酪蛋白（內(nèi)標(biāo)）SOSKVL'(乜，」n)PVPQKAVPY1648.07K-酪蛋白YIPIQYVLSR1251.58K-酪蛋白（內(nèi)標(biāo)）KIAKYIPIQYVL*(乜，伏)SRYPSY2209.6表A.2酪蛋白各亞型蛋白相關(guān)信息表亞型Uniprot代碼氨基酸數(shù)目相對(duì)分了里Mw(Dalton即g/mol)asi酪蛋白P02662(CASA1_BOVIN)21424529as2酪蛋白P02663(CASA2_BOVIN)22226019B酪蛋白P02666(CASB_BOVIN)22425107K酪蛋白P02668(CASK_BOVIN)19021269注：以上酪蛋白各亞型的分子量來源于UniProt數(shù)據(jù)庫（）,可通蛋白數(shù)據(jù)庫代碼在網(wǎng)站上查詢酪蛋白相關(guān)參數(shù)。附錄B酪蛋白檢測(cè)流程示意圖稱取1?獨(dú)固體樣品或者10mL液體樣叢60T.水浴lh.冷卻后定容至50mL加入到惟影

瓶中后用

30mLTns-

HCI溶液溶

解揄入10mlNK1取u10mL-1t溶解液渦貨混勾調(diào)附體2,8<€系的pHFiifk1aM——)10OOOr/mm高心15min?棄去上清在

4.1*

之間液.收集沉淀蛋白稱lU05?1g為檢氏*4或者l?2ml.班體孔步驟5.1試樣正白提取樣品中沉淀

的素白步驟，2試樣軟溶步驟成樣總蛋白含■測(cè)定及

成樣的稀料11k口品向上述沉淀中加入Tris-HCI溶液SmL港“60c水浴?<30mmI0000r/mm'舄心IhnnitBradford液，，.夏溶量自沉淀重安提取一保曲F5P5n*理明上E41“A”出一^次.靖合先后共兩次總體枳為IdmLV曼溶體定急擊fl

含吊若樣品中g(shù)赤白師的濃度不在0.2?。,7mgeL之間,則需要稀蜂到此范根內(nèi)用記業(yè)稀將倍數(shù)復(fù)溶的蛋臼幡林液

（已知總蛋白濃度）步驟S.5試樣的曲解2號(hào)

樣品在新L5mL的EP管中加入濃炭為一0.2M）.7ing/mL之間的義溶策臼溶液2005按370c.再分別加入40|iLw/w=120IWl加長內(nèi)標(biāo)權(quán)應(yīng)混標(biāo)—計(jì)算一X工作液（濃度均為加腳鼠.i2.5jimoLL> 并且定容—1mL16h■loooocr*r『mifi禹心K-，|~?20pL5-IOmmt.-10%取上清液甲審溶液分析V定咨體祖c常定濃度校正胰蛋白瞬漏切附錄c酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖5制量白YLGYLEQI4R明姐*臺(tái)FALPQYLK0?春白VLPVPQKncffi工■量白YIHQYVl^Rncffi工■量白YIHQYVl^R圖D.1酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(5jimol/L)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖本方法負(fù)責(zé)起草單位：中國食品藥品檢定研究院。驗(yàn)證單位：浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、上海市食品藥品檢驗(yàn)所、綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司、大連出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、酒泉市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心主要起草人：孫姍姍、劉柱、李曉雯、郝星凱、張曉林、李婷婷氯化鈉(NaCl)。乙月青(CH3CN)：質(zhì)譜級(jí)。三羥甲基氨基甲烷(Tris,C4HnNO3)o聚乙二醇辛基苯基醴(TritonX-100,C34H胰蛋白酶(Trypsin,C6Hl5O12P3)：質(zhì)譜級(jí)，豬源、牛源、基因工程來源均可；建議采用基因工程級(jí)的胰蛋白酶以降低雜酶的影響。試劑配制鹽酸溶液(6mol/L)：吸取25mL濃鹽酸，用水稀釋并定容至50mL。甲酸溶液(10%V/V)：吸取1mL甲酸，用水稀釋并定容至10mL。醋酸溶液(0.3%V/V)：吸取0.3mL醋酸，用水稀釋并定容至100mL。324氯化鈉溶液(0.5mol/L,含0.2%Triton-X100)：稱取14.625g,加200mL水溶解后,加入1mLTritonX-100(3.1.7),混勻溶解后，用水定容至500mL。Tris-HCl溶液(50mmol/L)：稱取6.057gTris,加900mL水溶解,用6mol/L鹽酸溶液)調(diào)pH至8.5后，用水定容至1000mL,經(jīng)0.45pim微孔濾膜過濾，備用。胰蛋白酶液：用醋酸溶液(3.2.3)將胰蛋白酶粉末溶解至Img/mL后，按照單次使用量進(jìn)行稀釋分裝，如每瓶50錯(cuò)誤味找到引用源。L或100錯(cuò)誤味找到引用源。L的0.2mg/mL胰蛋白酶,-8(TC冷凍保存，避免反復(fù)凍融。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(基于考馬斯亮藍(lán)-Bradford測(cè)定法或BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法均可)。甲酸水溶液（0.1%V/V）：吸取0.5mL甲酸，用水稀釋并定容至500mL。標(biāo)準(zhǔn)品3313-酪蛋白特征肽標(biāo)準(zhǔn)品：YLGYLEQLLR,純度須準(zhǔn)確標(biāo)定，或經(jīng)國家認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。as2-酪蛋白特征肽標(biāo)準(zhǔn)品：FALPQYLK,純度須準(zhǔn)確標(biāo)定，或經(jīng)國家認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3330-酪蛋白特征肽標(biāo)準(zhǔn)品：VLPVPQK,純度須準(zhǔn)確標(biāo)定，或經(jīng)國家認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。334K-酪蛋白特征肽標(biāo)準(zhǔn)品：YIPIQYVLSR,純度須準(zhǔn)確標(biāo)定，或經(jīng)國家認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。asi-酪蛋白特征肽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：PSERYLGYL*（心NEQLLRLKKY.HPLC級(jí)純度N98%。as2-酪蛋白特征肽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：RYOKFALPOYL*（乜，皈）KTVYO,HPLC級(jí)純度N98%。0-酪蛋白特征肽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：SOSKVL"（i3c$,）n）PVPQKAVPY.HPLC級(jí)純度N98%。k-酪蛋白特征肽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：KIAKYIPIOYVL*（於（2§,15n）SRYPSY.HPLC級(jí)純度N98%。L*（13C6,15N）同位素標(biāo)記亮氨酸，以上標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子量見附錄A表Al。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（400|imol/L）：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品純度及肽段標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子量計(jì)算不同酪蛋白亞型（3.3.1-3.3.4）稱樣量，精確稱取適量（精確至0.01mg）標(biāo)準(zhǔn)品后，用Tris-HCl溶液（3.2.5）溶解,定容于10mL容量瓶中，各酪蛋白亞型特征肽（331-334）濃度均為400|imol/L,此溶液密封后-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存，有效期3個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取各酪蛋白亞型特征肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（341）1mL至100mL容量瓶中,加入Tris-HCl溶液（325）稀釋至刻度，得到各酪蛋白亞型特征肽濃度為4|imol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液密封后-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存，有效期1個(gè)月。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.4.2),用純水稀釋，配制成濃度依次為0.02(imol/L>0.1|imol/L>0.2|imol/L>1.0|imol/L>211moi/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存，有效期1周。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10pmol/L)：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品純度及肽段標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子量計(jì)算不同酪蛋白亞型(33.5-3.3.8)稱樣量，精確稱取適量(精確至0.01mg)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品后，用Tris-HCl溶液(3.2.5)溶解，配制成各酪蛋白亞型特征肽(335-338)濃度均為10|imol/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，此溶液密封后-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存，有效期3個(gè)月。內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確分別吸取0.25mL各酪蛋白亞型特征肽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(3.4.4)混合，配制成濃度為2.5pmol/L內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存，有效期1個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品酶解溶液：分別準(zhǔn)確吸取500(1L各系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(3.4.3)到2mL低吸附聚丙烯(PP)離心管中，向每個(gè)濃度中加入40(1L內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(345),再加入5|iL的。.2mg/mL的胰蛋白酶液(326)(含1pig胰蛋白酶)，用純水定容至1mL后充分渦旋，在1000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下，離心1min。蓋緊瓶蓋，在37錯(cuò)誤!未找到引用源。水浴或者恒溫箱內(nèi)孵育15-16h后，取出加入20|iL10%的甲酸溶液(3.2.2)終止酶解反應(yīng)?；靹蚝螅?0000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下離心10min,靜置，取上清液備用。上清液在-20錯(cuò)誤!未找到引用源。冷凍保存放置4-5天內(nèi)穩(wěn)定。材料低吸附型2mL、15mL、50mL聚丙烯(PP)離心管。低吸附型聚丙烯（PP）槍頭。低吸附型聚苯乙烯（PS）96孔板（用于總蛋白含量測(cè)定）。4儀器和設(shè)備高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。酶標(biāo)儀。分析天平：感量分別為0.001g、0.0001g和0.00001g。低溫離心機(jī)：轉(zhuǎn)速N6000r/mino恒溫水浴鍋或可控溫培養(yǎng)箱。pH計(jì)。渦旋振蕩器。5分析步驟試樣蛋白提取含乳飲料固體試樣（若含乳包裝為獨(dú)立包裝，應(yīng)與其他調(diào)味粉末混合后取樣，例如：咖啡、奶茶等飲品）：試樣稱取1g?5g（精確至0.001g）于錐形瓶中；若為乳飲料液體試樣：精密量取試樣10mL于錐形瓶中，加入30mL預(yù)溫（40錯(cuò)誤!未找到引用源。）的Tris-HCl溶液（325）,混勻后,放入60錯(cuò)誤!未找到引用源。水浴恒溫振蕩1h,取出冷卻后用Tris-HCl溶液（325）轉(zhuǎn)移定容至50mL容量瓶（V溶解體枳）。乳粉原料粉試樣：稱取試樣0.5g?1g（精確至0.001g）于錐形瓶中；若為液體乳試樣：精密量取試樣1?2mL于錐形瓶中，加入30mL預(yù)溫（40錯(cuò)誤!未找到引用源。）的Tris-HCl溶液（325）,混勻后，放入60錯(cuò)誤!未找到引用源。水浴恒溫振蕩1h,取出冷卻后用Tris-HCl溶液（3.2.5）轉(zhuǎn)移定容至50mL容量瓶（V溶解體積）。精密量取10mL（V沉淀體積）上述完全溶解的試樣溶液（視檢無明顯結(jié)塊），按體積比（v/v=l:l）加入10mL氯化鈉溶液（324）,渦旋振蕩?；靹蚝?，用10%甲酸溶液（322）調(diào)節(jié)試樣的pH值到4.6?4.8之間，2-8錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下靜置過夜，待所有蛋白沉淀析出。已析出的沉淀試樣在10000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下離心15min,棄去上清液，沉淀以備復(fù)溶。試樣復(fù)溶向上述沉淀試樣（5.1）中加入5mLTris-H。溶液（325）,渦旋振蕩5?10min,使溶液充分溶解，放入60錯(cuò)誤!未找到引用源。水浴恒溫振蕩30min,取出后繼續(xù)混勻（視檢無明顯結(jié)塊）。試樣溶液在10000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下離心15min,棄去沉淀，留取上清液。上述步驟重復(fù)1次，合并兩次復(fù)溶的上清液后，可用Tris-HCl溶液（3.2.5）定容至10mL（V復(fù)溶體積）。試樣總蛋白的含量測(cè)定按照Bradford或BCA法試劑盒所述方法測(cè)定復(fù)溶試樣溶液（5.2）中總蛋白質(zhì)的含量（單位：mg/mL）o試樣的稀釋為保證該實(shí)驗(yàn)在最佳的酶解效率下進(jìn)行，需根據(jù)試樣中總蛋白的含量測(cè)定結(jié)果（5.3）,用Tris-HCl溶液（3.2.5）對(duì)復(fù)溶后的試樣溶液進(jìn)行稀釋（f3稀釋倍數(shù)），使試樣稀釋液中的總蛋白含量保持在0.2mg/mL?0.7mg/mL之間。試樣的酶解該實(shí)驗(yàn)的最佳酶解效率為：酶的質(zhì)量/總蛋白質(zhì)量=1:20,根據(jù)此原則推算，若試樣稀釋液中總蛋白含量在0.2mg/mL?0.7mg/mL之間，按取樣量200HL進(jìn)行酶解（V函解體積），則其對(duì)應(yīng)的總蛋白質(zhì)質(zhì)量范圍在40朗?140/g之間，加入胰蛋白酶的量則在2席?7|ig范圍內(nèi)。取200^iL（丫酶解體積）稀釋后的試樣（5.4）,按照上述計(jì)算依據(jù)，加入適量胰蛋白酶液（326）,向試樣中加入40|1L內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.4.5）,用純水定容至1mL（V定容體積）后充分渦旋，在1000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下，離心1min。蓋緊瓶蓋，在37錯(cuò)誤!未找到引用源。水浴或者恒溫箱內(nèi)孵育15-16h后，取出加入20pL10%的甲酸溶液（3.2.2）終止酶解反應(yīng)。混勻后，在10000r/min,4錯(cuò)誤!未找到引用源。條件下離心10min,靜置，上清液以備分析。注：當(dāng)回收率達(dá)不到本標(biāo)準(zhǔn)要求時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)蛋白酶活力進(jìn)行評(píng)價(jià)?？梢赃x用市售標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)控樣品（標(biāo)明準(zhǔn)確蛋白含量且已知目標(biāo)肽段分子量的產(chǎn)品）隨行酶解步驟，檢測(cè)評(píng)估及控制。儀器參考條件液相色譜參考條件a）色譜柱：Ci8親水柱（T3）,柱長100mm,內(nèi)徑2.1mm,粒徑1.8|im,填料孔徑錯(cuò)誤!未找到引用源。iooA或性能相當(dāng)者；b）流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸.水溶液（3.2.8）,流動(dòng)相B為乙晴（3.1.5）,參考梯度洗脫程序見表1;c）流速：。.3mL/min；d）柱溫：30錯(cuò)誤!未找到引用源。；e）進(jìn)樣量：5|1L；表1參考梯度洗脫程序時(shí)間(min) A：0.1%甲酸-水溶液(％) B：乙月青(%)TOC\o"1-5"\h\z