單味代表藥的通絡(luò)作用研究

單味代表藥的通絡(luò)作用研究

心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，其診斷和治療引起了現(xiàn)代藥理工作者的關(guān)注。高同型半胱酸血癥(HHcy)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來(lái)許多研究表明,HHcy能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷和功能障礙,從而促進(jìn)心血管病的發(fā)生和發(fā)展。而內(nèi)皮功能障礙能加速、加重微循環(huán)障礙和微血栓形成。目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮功能障礙可能在冠脈痙攣的發(fā)病機(jī)制或潛在機(jī)制中扮演重要角色。絡(luò)氣郁滯是“絡(luò)脈-血管系統(tǒng)病變學(xué)說(shuō)”發(fā)生的始動(dòng)因素;絡(luò)脈瘀阻和絡(luò)脈絀急是絡(luò)病中主要的病理變化。近年來(lái),根據(jù)“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病變學(xué)說(shuō)”理論研制出的治療心腦血管病的代表方藥通心絡(luò)取得了良好的臨床療效。通心絡(luò)全方由人參、土鱉蟲(chóng)、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、降香、冰片等藥物組成,集中應(yīng)用絡(luò)虛通補(bǔ)藥、蟲(chóng)類化瘀通絡(luò)藥、蟲(chóng)類搜風(fēng)通絡(luò)藥和辛味通絡(luò)藥組方,具有益氣活血、搜風(fēng)通絡(luò)的作用。本課題組研究已證實(shí)通心絡(luò)對(duì)絡(luò)脈瘀阻和絡(luò)脈絀急有顯著的防治效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮損傷合并微血栓形成(絡(luò)脈瘀阻)及內(nèi)皮損傷合并急性心肌缺血(絡(luò)脈絀急)大鼠模型,探討具有通絡(luò)作用的單味代表藥的通絡(luò)效果,并與復(fù)方通心絡(luò)進(jìn)行比較。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量(150±20)g,由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.2水從機(jī)械注射用針劑的配制通心絡(luò)超微粉、人參、薤白、蜈蚣、水蛭均由河北以嶺醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供(通心絡(luò)超微粉、人參、薤白、蜈蚣為粉狀提取物,用純水配成相應(yīng)溶液,水蛭為腹腔注射用針劑;實(shí)驗(yàn)中以上藥品所用劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的最佳劑量)。L-蛋氨酸、琥珀?；前粪邕?SST)、乙酰膽堿(Ach)、角叉菜膠、脂多糖(LPS)、精氨酸加壓素(AVP)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,NO測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所,血管性假血友病因子(vWF)ELISA試劑盒購(gòu)于上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。2方法2.1大內(nèi)傷模型2.1.1等離子體處理大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、通心絡(luò)組、人參組、薤白組、蜈蚣組及水蛭組。除對(duì)照組外各組動(dòng)物均ig給予蛋氨酸1g/kg,SST0.5g/kg加入飲水,持續(xù)4周,對(duì)照組予以等量純水處理。通心絡(luò)組于ig蛋氨酸第4周開(kāi)始ig給予通心絡(luò)0.4g/kg,持續(xù)7d,人參組、薤白組、蜈蚣組于ig蛋氨酸第2周開(kāi)始分別ig給予人參、薤白、蜈蚣1.2g/kg,持續(xù)3周,水蛭組于ig蛋氨酸第2周開(kāi)始ip給予水蛭1.6U/kg,持續(xù)3周。2.1.2動(dòng)脈環(huán)的制作(1)4周后各組大鼠以4%戊巴比妥鈉ip麻醉后心臟采血0.5mL,與3.8%枸櫞酸鈉按9∶1混合均勻,4℃、3000r/min離心10min,取血清,分別采用硝酸還原酶法及酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測(cè)NO及vWF值。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠主動(dòng)脈,置于連續(xù)通含95%O2和5%CO2混合氣體的改良Kerbs溶液(mmol/L:NaCl118、KCl4.7、CaCl22.6、MgSO4·7H2O1.2、KH2PO41.2、NaHCO325、葡萄糖5.5,pH7.4)中,小心分離周圍脂肪和結(jié)締組織,注意勿牽拉,保護(hù)內(nèi)皮,將動(dòng)脈條剪成3mm左右的環(huán)。動(dòng)脈環(huán)置于37℃含4mLKerbs液的恒溫浴槽中,一端固定于浴槽底部,另一端連接于張力換能器(JZ101)。浴槽中持續(xù)通含95%O2和5%CO2混合氣體,并每隔20min換液1次,內(nèi)槽恒溫37℃,負(fù)荷1.5g,平衡1.5h。收縮張力信號(hào)通過(guò)MP—285Micromanipulatorsys(USA)的八通道接頭傳輸?shù)脚cPowerlab系統(tǒng)(ADinstruments,USA)相連的MacOSMacintosh計(jì)算機(jī)上,直接采用Powerlab系統(tǒng)及其軟件ChartforWindows進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析。實(shí)驗(yàn)前預(yù)先給予100mmol/LKCl收縮血管,在隨后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每一步實(shí)驗(yàn)完成后,及時(shí)沖洗,待曲線回至基線并穩(wěn)定25min后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。血管環(huán)高鉀預(yù)收縮穩(wěn)定沖洗至基線平衡后,4mLKrebs液定容,加入1×10-4mol/L苯腎上腺素40μL(終濃度為1×10-6mol/L),待收縮反應(yīng)達(dá)平臺(tái)后,①以不同累積濃度(1×10-10～1×10-6mol/L)的Ach作用于血管環(huán),記錄各濃度下血管環(huán)的舒張率,觀察Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng);②以不同累積濃度(1×10-9～1×10-5mol/L)的硝普鈉(SNP)作用于血管環(huán)記錄各濃度下血管環(huán)的舒張率,觀察SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。2.2大鼠顱內(nèi)損傷和微血栓形成絡(luò)脈血栓形成模型2.2.1內(nèi)皮損傷模型的建立大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、通心絡(luò)組、人參組、薤白組及水蛭組。除對(duì)照組外,各組大鼠在內(nèi)皮損傷模型制備(2.1.1項(xiàng)方法)基礎(chǔ)上ip角叉菜膠10mg/kg,16h后ipLPS0.2mg/kg,對(duì)照組ip等量生理鹽水。給藥方法同2.1.1項(xiàng)。2.2.2纖血液流變學(xué)檢測(cè)①注射LPS后20h,心臟采血1mL,與3.8%枸櫞酸鈉按9∶1混合均勻,以3000r/min、4℃離心15min,收集血漿,在2h內(nèi)記錄凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT),檢測(cè)纖維蛋白原(FG)水平。另心臟采血0.5mL,使用1.8mg/mLEDTA抗凝管收集血液,4℃離心15min,收集血漿,2h內(nèi)檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)(PLT)。以上均由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部檢測(cè)。②注射LPS后20～24h,觀測(cè)大鼠腸系膜微循環(huán):實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食12h,用4%戊巴比妥鈉ip麻醉后固定,于腹腔一側(cè)做3～4cm的切口,輕輕拉出腸系膜,置于37.0℃的恒溫水浴槽內(nèi),選擇適宜觀察處并固定,置于三目顯微鏡下觀察腸系膜微循環(huán)血流速度、動(dòng)脈口徑及流態(tài),通過(guò)BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)錄像。并采用微血管流態(tài)半定量法,根據(jù)血液流動(dòng)狀態(tài),將流速分為7個(gè)等級(jí),配合使用光點(diǎn)跟蹤法,對(duì)微循環(huán)改變進(jìn)行量化,計(jì)分越大,表示微循環(huán)障礙越明顯。③注射LPS24h后采血,采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測(cè)定血漿vWF值。2.3大鼠內(nèi)戰(zhàn)和急性心肌缺血絡(luò)脈急性的模型2.3.1內(nèi)皮損傷模型制備大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、通心絡(luò)組、人參組、薤白組、蜈蚣組及水蛭組。除對(duì)照組外,各組大鼠在內(nèi)皮損傷模型制備(2.1.1項(xiàng)方法)基礎(chǔ)上禁食18h后,ip4%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉,頸靜脈ivAVP0.1mL/100g。給藥方法同2.1.1項(xiàng)。2.3.2t波低壓試驗(yàn)①記錄AVP注射后標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖(30min),測(cè)量注射AVP后0、15、30s和1、2、3、4、5、10、20、30min時(shí)T波壓低幅度。②記錄心電圖后采血,采用硝酸還原酶法測(cè)定血漿NO水平。2.4統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果以ˉx±sxˉ±s表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果3.1預(yù)防和處理內(nèi)傷的內(nèi)部損傷3.1.1各組大鼠血清中通心絡(luò)組的比較人參組、薤白組、蜈蚣組及水蛭組血漿NO水平均顯著高于模型組,其中通心絡(luò)組升高更為明顯;人參組、薤白組、蜈蚣組及水蛭組血漿vWF水平顯著低于模型組,其中通心絡(luò)組降低更為明顯。見(jiàn)表1。3.1.2各組非內(nèi)皮依賴性血管的張力在Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)中,人參組、薤白組、蜈蚣組和水蛭組最大舒張率較模型組均有所升高,其中通心絡(luò)組升高更為明顯。在SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)中,各組間舒張率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖1和2。3.2預(yù)防和處理內(nèi)傷和多脈血栓形成絡(luò)脈血栓形成3.2.14個(gè)項(xiàng)目和plt的結(jié)果各用藥組的FG水平與模型組比較顯著升高;通心絡(luò)組和水蛭組PLT顯著高于模型組。見(jiàn)表2。3.2.2各組血漿vxf水平比較通心絡(luò)組和水蛭組血漿vWF水平顯著低于模型組(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、通心絡(luò)組、人參組、薤白組、水蛭組血漿vWF水平(n=8)分別為0.0514±0.0267、0.1750±0.0760、0.1013±0.0253、0.1131±0.0775、0.1254±0.0623、0.0814±0.0752。3.2.3血液流變性檢查鏡下可見(jiàn)模型組毛細(xì)血管甚至小血管阻塞,血管邊緣模糊,血管周圍彌漫性、片狀滲血或大片瘀血,血液流變異常,顆粒感明顯,呈粒緩流或粒擺流,紅細(xì)胞呈中、重度聚集。各用藥組腸系膜微循環(huán)血流速度明顯加快,偶見(jiàn)瘀血,無(wú)滲血,基本無(wú)紅細(xì)胞聚集現(xiàn)象。見(jiàn)表3。3.3治療傷口損傷、急性心肌缺血絡(luò)脈郁結(jié)的綜合治療3.3.1模型組t波低壓幅度通心絡(luò)組在注射AVP后30s～3min各時(shí)間點(diǎn)T波壓低幅度與模型組相比均顯著降低;蜈蚣組注射AVP后30s及2minT波壓低幅度較模型組明顯降低,見(jiàn)表4。3.3.2血漿no水平各用藥組血漿NO值均顯著高于內(nèi)皮損傷合并急性心肌缺血組(P<0.05),其中通心絡(luò)組升高更為明顯。對(duì)照組、模型組、通心絡(luò)組、人參組、薤白組、蜈蚣組、水蛭組血漿NO水平(n=8)分別為(33.53±9.819)、(9.127±5.449)、(27.78±7.048)、(25.38±6.997)、(17.31±5.038)、(18.05±2.863)、(26.42±6.76)μmol/L。4促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷的作用根據(jù)絡(luò)病學(xué)說(shuō),脈與絡(luò)是以運(yùn)行血液為主要功能的組織結(jié)構(gòu)部分,脈絡(luò)與中小血管及微循環(huán)概念有高度的一致性,在此基礎(chǔ)上把傳統(tǒng)中醫(yī)絡(luò)病理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中小血管及微循環(huán)病變結(jié)合起來(lái)提出了“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病變學(xué)說(shuō)”。病理上絡(luò)氣郁滯引起的絡(luò)脈自穩(wěn)狀態(tài)功能異常與血管內(nèi)皮功能障礙具有內(nèi)在一致性,均為“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)”病變的始動(dòng)因素。絡(luò)脈瘀阻和絡(luò)脈絀急是絡(luò)病中主要的病理變化。“絡(luò)以通為用”是中醫(yī)治療絡(luò)病的原則,益氣通絡(luò)(人參),辛溫通絡(luò)(薤白、降香),活血通絡(luò)(水蛭)為主要通絡(luò)治法。各通絡(luò)藥物有不同的通絡(luò)特異性,人參補(bǔ)氣容絡(luò),生津固脫;薤白辛溫通陽(yáng),暢通絡(luò)氣;降香辛香通絡(luò),理氣化瘀;水蛭化瘀通絡(luò),破血逐瘀。通絡(luò)復(fù)方通心絡(luò)是近年應(yīng)用絡(luò)病學(xué)說(shuō)與通絡(luò)藥物治療心血管病的代表性方藥,各通絡(luò)藥物按君、臣、佐、使原則組合,益心氣扶正以固本虛,使氣旺血行、脈絡(luò)暢通。血管內(nèi)皮損傷或(和)功能障礙是血管病變始動(dòng)及發(fā)展加重的首要因素,內(nèi)皮功能障礙能加速、加重微循環(huán)障礙和微血栓形成。目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮功能障礙可能在冠脈痙攣的發(fā)病機(jī)制或潛在機(jī)制中扮演重要角色。內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的降低或消失是國(guó)際公認(rèn)的評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能障礙的金標(biāo)準(zhǔn),NO是血管內(nèi)皮所合成分泌的最重要的血管活性物質(zhì)。NO具有擴(kuò)張血管、抗血小板黏附聚集、抗血管平滑肌細(xì)胞增生等作用,血漿NO水平可作為血管內(nèi)皮損傷程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。vWF可促進(jìn)血小板的黏附與聚集,如血漿vWF水平也間接表明血管內(nèi)皮損傷程度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮損傷合并微血栓形成(絡(luò)脈瘀阻)及內(nèi)皮損傷合并急性心肌缺血(絡(luò)脈絀急)大鼠模型,探討通絡(luò)代表藥的通絡(luò)效果,并將其與復(fù)方通心絡(luò)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通絡(luò)代表藥對(duì)飲食誘導(dǎo)的HHcy所致的內(nèi)皮損傷有防治作用,可以改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能,升高血漿NO水平,降低血漿vWF水平,起到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用,而通心絡(luò)的作用更為明顯;通絡(luò)代表藥干預(yù)內(nèi)皮損傷合并微血栓形成模型,可以顯著降低血漿