軍團菌檢驗課件

軍團菌檢驗九江市CDC金盛楠2011.09軍團菌檢驗九江市CDC金盛楠1軍團菌的發(fā)現(xiàn)

◆1976年7月美國費城斯特拉福賓館召開58屆退伍軍人大會（AmericanLegionConvention）,會后短期內(nèi)，發(fā)生不明原因以呼吸道為主的疾病爆發(fā)，數(shù)百人中共發(fā)病182人，死亡29人。共發(fā)病221人，死亡34人。

◆這種細菌很可能通過空氣傳播，當時未查明傳染源，按流行病學分析，可能是聚會賓館。

◆人與人之間的傳播證據(jù)不明確。

◆

許多賓館工作人員具有免疫力。

◆

證明是一種細菌性肺炎，進行豚鼠接種，分離到一株革蘭陰性桿菌，該細菌可以接種于雞胚的卵黃囊。軍團菌的發(fā)現(xiàn)◆1976年7月美國費城斯特拉2Gram-stainedmicrographofLegionellapneumophilabacteriafromavictimofthe1976Legionnaires'diseaseoutbreakinPhiladelphia.Gram-stainedmicrographofLeg3證明分離到的革蘭陰性菌為軍團病的病原體。（科赫原則）證明分離到的革蘭陰性菌為軍團病的病原體。（科赫原則）4軍團菌的命名1979年在第一次國際軍團病會議上正式命名為嗜肺軍團菌（legionellapneumonphila,Lp）。此次為新的呼吸道細菌性傳染病暴發(fā)，會議命名為軍團?。↙egionnaires’Disease）。ScientificclassificationDomain:BacteriaPhylum:ProteobacteriaClass:GammaproteobacteriaOrder:LegionellalesFamily:LegionellaceaeGenus:LegionellaSpecies軍團菌的命名1979年在第一次國際軍團病會5病原學◆形態(tài)染色：革蘭陰性桿菌，中等大小?！艟w呈多形性，因培養(yǎng)條件而異。有時呈現(xiàn)8~20μm或更長絲狀相互纏繞。◆無莢膜，無芽孢，有端生鞭毛能運動。◆細胞壁內(nèi)含有大量的側(cè)鏈脂肪酸可做軍團菌分型的依據(jù)，占菌體總脂肪酸量的68%以上。TransmissionelectronmicrographofLegionella

病原學◆形態(tài)染色：革蘭陰性桿菌，中等大小。Transmiss6軍團菌在自然界廣泛存在，主要由表層水體、泥巴、有一定溫度的湖泊溪流中分離到，主要自然界真核細胞胞內(nèi)寄生。目前報道了超過50個種與70個血清型。80%水環(huán)境樣品PCR能檢測到軍團菌特異性核酸，40%水環(huán)境樣品能分離到軍團菌。影響水環(huán)境中軍團菌的主要因素1、細菌的存在2、較高的水溫3、周圍環(huán)境中阿米巴原蟲4、Fe2+軍團菌在自然界廣泛存在，主要由表層水體、泥巴7ThepatternofLegionellagrowsinAmoebaThepatternofLegionellagrow8軍團菌生長特性◆耐酸PH3.0存活數(shù)小時。◆耐熱◆嗜鐵性培養(yǎng)基需加入焦磷酸鐵◆對NA+敏感NA+抑制生長根據(jù)WHO官方網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，溫度對軍團菌生長的影響如下：◆

Above70°C(158

°F)-幾乎立即死亡◆

At60°C(140

°F)-90%在2分鐘內(nèi)死亡

(Decimalreductiontime(D)=2)◆

At50°C(122

°F)-90%在80-124分鐘內(nèi)死亡,根據(jù)菌株不同而有所區(qū)別

(Decimalreductiontime(D)=80-124)◆

48to50°C(118

to122

°F)–能夠生存，但不能繁殖◆

32to42°C(90

to108

°F)–理想生長溫度

◆

25to45°C(77

to113

°F)–生長溫度范圍

◆

Below20°C(68

°F)–能生存，處于休眠狀態(tài)，即使在冰凍條件下

軍團菌生長特性◆耐酸PH3.0存活數(shù)小時。根據(jù)WHO官方網(wǎng)9軍團菌增殖的條件和場所能產(chǎn)生氣溶膠的場所：◆淋浴花灑，龍頭◆溫泉，水浴池◆蒸氣浴、桑拿◆空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔、冷凝器◆室內(nèi)觀賞性噴泉◆熱水和冷水塔或儲水罐◆

20～45℃熱水◆水流靜止或緩慢的管道中◆黏土（管道不清潔，淋浴花灑堵塞，龍頭污垢）◆含有天然橡膠或天然纖維的洗衣機◆水加熱器賓館飯店軍團菌感染潛在的危險因素軍團菌增殖的條件和場所◆熱水和冷水塔或儲水罐賓館飯店軍團10軍團菌衛(wèi)生學指標美國：冷卻塔水軍團菌濃度應≤100cfu/mL；冷熱水系統(tǒng)水應≤10cfu/mL；加濕器水應≤1cfu/mL澳大利亞、新加坡:冷卻塔水軍團菌濃度應≤10cfu/mL；其他不能檢出我國:集中空調(diào)通風系統(tǒng)冷卻水和冷凝水中不得檢出嗜肺軍團菌。（？）軍團菌衛(wèi)生學指標美國：11廣泛分布的多灶性纖維素化膿性炎癥，常伴有纖維蛋白性胸膜炎和少量粘液性滲出胸膜炎。受感染的人或動物由呼吸道分泌物、痰、血液與胸水中分離到軍團菌，均可查到軍團菌抗體。未進行有效抗生素治療，病死率很高。治療公認首選藥物為紅霉素，療效可靠阿奇霉素、克拉霉素可能有效，不確定。利福平有效，但易產(chǎn)生耐藥菌株，只能作為輔助藥物氨基甙類、青霉素、頭孢類抗生素對本病無效。軍團菌肺炎的主要病理特征廣泛分布的多灶性纖維素化膿性炎癥，常伴有纖維12Twoclinicalsyndromes:Legionnaires'diseaseandPontiacfever.軍團菌感染的兩種臨床癥狀：軍團菌肺炎與龐蒂亞克熱

Legionnaires'diseasePontiacfeverClinicalfeaturesPneumonia:cough,fever,chestpainFlu-likeillness(fever,chills,malaise)withoutpneumoniaRadiographicpneumoniaYesNoIncubationperiod2-14daysafterexposure24-48hoursafterexposureEtiologicagentLegionellaspeciesLegionellaspeciesAttackrate*<5%>90%IsolationoforganismPossibleVirtuallyneverOutcomeHospitalizationcommonCase-fatalityrate:5-30%**HospitalizationuncommonCase-fatalityrate:0%*Percentofpersonswho,whenexposedtothesourceofanoutbreak,becomeill.**PercentofpersonswhodiefromLegionnaires'diseaseorPontiacfever.Twoclinicalsyndromes:Legion13流行病學特點1、傳染源兼性厭氧保內(nèi)寄生菌，廣泛存在于自然界水源與人工管道水源中，空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔、循環(huán)蓄水池等是軍團菌的常住地。主要寄生在原核生物細胞體內(nèi)，如阿米巴。原核生物不但提供各種軍團菌所需要的營養(yǎng)成分，在環(huán)境不利的情況下也為軍團菌提供了一個庇護的場所，也是軍團菌轉(zhuǎn)移、遷徙與感染高等動物與人的載體。原蟲被軍團菌裂解后大量的菌體被釋放到水體、環(huán)境中，通過賓館一些能產(chǎn)生氣溶膠的器件而被人體吸入感染。流行病學特點1、傳染源142、傳播途徑呼吸道的吸入是最可能的傳播途徑，含有軍團菌的氣溶膠顆粒通過空氣由人直接吸入肺泡而致病。經(jīng)口或消化道感染軍團病的可能性很小。已證實在開挖土壤、溝渠時可能有軍團病的暴發(fā)流行。人由肺泡感染軍團菌后，似乎軍團菌的傳染就停止了。至今未發(fā)現(xiàn)人與人之間的傳播。（？）2、傳播途徑153、易感人群人對軍團菌普遍易感，以中老年人多見，男性多于女性?；A免疫力較低，長期吸煙者、長期從事賓館、醫(yī)院工作者、長期旅行者、糖尿病、臟器衰竭或因病服用免疫抑制劑、類固醇激素等患者得病風險顯著升高。在免疫缺陷人群中易導致嚴重感染至死亡。HIV感染合并軍團菌感染而死亡的病例屢見報道。4、季節(jié)性全年均有發(fā)生。夏秋季節(jié)是軍團病的高發(fā)季節(jié)。可能由于夏秋季溫度較高，有利于軍團菌生長繁殖，另外夏秋季節(jié)中央空調(diào)使用頻率也高。3、易感人群16軍團菌胞內(nèi)致病機制manipulatehostcellvesicular-traffickingpathwaysandestablishamembrane-boundreplicationvacuole,makingitmodelforintracellularor,morespecifically,intravacuolarpathogens.Regularphagocytosisvs.Legionellaintracellularparasitism軍團菌胞內(nèi)致病機制manipulatehostcell17軍團菌檢驗課件18培養(yǎng)特性◆專性需氧，2.5～5%CO2能促進生長。◆最適生長溫度35～

36℃，最適PH6.9?！魻I養(yǎng)要求特殊，在普通培養(yǎng)基上不生長，生長需要L-半胱氨酸和鐵鹽。生長緩慢，固體培養(yǎng)基2-14天。◆目前公認分離軍團菌最好的培養(yǎng)基是緩沖炭粉酵母浸膏瓊脂加入-酮戊二酸（BCYE-α平板，bufferedchacoalyeastextract）。在此平板上一般需4天能發(fā)育為白色或灰白色，光滑濕潤，毛玻璃樣的典型軍團菌菌落。菌落直徑可達2～

3mm，接種針觸之柔軟。菌落在紫外燈下有熒光?！粼诓缓琇-半胱氨酸的BCYE或血平板上不生長。培養(yǎng)特性◆專性需氧，2.5～5%CO2能促進生長。19Legionellasp.coloniescultivatedonanBCYE-αLegionellasp.coloniesilluminatedusingultravioletlight.Legionellasp.coloniescultiv20LifecycleofLegionellaLaboratoryinvitrocultureinbrothExponentialphasebacteriaReplicative(non-infectious)formsofbacteriainexponentialgrowthstage,unflagellatedandsodiumresistant

Post-exponential(stationary)phasebacteriaInfectiousformsofbacteria,flagellatedandmotile;theyappearwhennutrientsbecomesparseandthepathohensbecomeovercrowdedLifecycleofLegionella21Naturallifecycle

IntracellularformNon-infectiousreplicatingformBacteriaactivelyreplicatinginLCVDifferentiatingformBacteriaatlastroundsofreplicationwhendaughtercellsacquirevirulenttraits(flagellae,resistancetoenvironmentalstresses,etc.)Free-swimmingformTransmissivevirulentformofbacteriathatescapedfromtheprevioushostandarereadytopenetratenextoneNaturallifecycle22生化反應（了解）軍團菌可從有機化合物攝取營養(yǎng)，利用氨基酸作為能量和碳的來源，既不發(fā)酵也不氧化糖類，不還原硝酸鹽。觸酶陽性或弱陽性，尿素酶陰性，液化明膠。除血清型4和15以外的各個菌株均有強烈的水解馬尿酸鹽的作用。生化試驗結(jié)果觸酶-氧化酶-硝酸鹽還原-尿素酶-明膠液化+水解馬尿酸+糖類發(fā)酵-抵抗力軍團菌在自然界中抵抗力很強，在自來水中可生存一年左右。對化學消毒劑敏感，0.05%苯酚1min可致死，對酸有抵抗力。生化反應（了解）軍團菌可從有機化合物攝取營養(yǎng)，利用氨23樣本的采集和運輸可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定病原菌名稱危害程度分類實驗活動所需生物安全實驗室級別運輸包裝分類學名中文名大量活菌操作動物感染實驗樣本檢測非感染性材料試驗A/BUN編號Legionellapneumophila嗜肺軍團菌第三類BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-2BUN3373樣本的采集和運輸可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣24標本采集環(huán)境標本采集冷卻塔：在冷卻塔使用一段時間后（一個月）采集。采樣前需關(guān)閉冷卻塔鼓風機，如不能關(guān)閉，應佩戴安全護目鏡和呼吸道防護裝備，帶橡膠手套。從池中采水，200~500mL，并測量記錄水溫。生活熱水（淋?。┫到y(tǒng)：采樣時，帶上一次性橡膠手套，用無菌棉簽采熱水（淋?。﹪婎^處涂抹一份放入無菌試管。然后關(guān)閉冷水龍頭，打開熱水龍頭放3min后，采集200~500mL放入無菌廣口瓶，關(guān)閉龍頭，記錄采樣時溫度。如果水中含有消毒劑，則應添加相應濃度的中和劑。標本采集25臨床標本采集呼吸道分泌物：采集疑似軍團菌肺炎病人包括痰、肺洗液、支氣管灌洗液（抽提物）肺組織等標本。尿標本采集：采集可疑病人尿標本，放入可密封的采尿杯中。血清標本：采集病人靜脈血2~3mL，放入不帶抗凝劑的采血管中，2000r離心10min，吸取上層血清，放入0.5~1mL的帶蓋的小離心管中。標本運送環(huán)境標本放入采樣箱，常溫運送，不必冷凍，標本最好在兩天內(nèi)送達實驗室，可室溫儲藏于實驗室（不超過2周）備檢。臨床標本4℃運送立即送檢，進行病原分離。血清標本如不能立即檢測，可放4℃暫存（一周內(nèi)）。臨床標本采集標本運送26幾種軍團菌培養(yǎng)基:◆BCYE-α◆

GVPC◆

VPC◆

BCYE-Cys◆

ABCYEmedium—Bovineserumalbumin(fractionV)10g/L幾種軍團菌培養(yǎng)基:◆BCYE-α27Bufferedcharcoalyeastextract(BCYE)agarComposition

charcoal2.0gYeastextract10.0gACESbuffer10.0gFerricpyrophosphate(soluble)0.25gL-cysteineHCl-H200.40gAgar,bacto(Oxoid)17.0gPotassiumalpha-ketoglutarate1.0gDistilledwater1,000mlAntibiodiccomponentsformedia1.GPCVmediumGlycine0.3%PolymyxinB100units/mlVancomycin5ug/mlCycloheximide80ug/ml2.PCVmedium–GPCVmediumwithoutglycineBufferedcharcoalyeastextrac281、臨床標本處理臨床標本（痰、氣管灌洗液等呼吸道分泌物或肺組織等）直接免疫熒光法鏡檢血清抗原抗體檢測尿抗原檢測無菌標本直接轉(zhuǎn)種GVPC或BCYE平板污染樣品進行酸處理或熱處理后轉(zhuǎn)GVPC平板取5ml血液接種BCYE雙相培養(yǎng)基第三天起挑選可疑菌落做鑒定36℃5%CO2，7~14d1、臨床標本處理臨床標本（痰、氣管灌洗液等呼吸道分泌物或肺組29環(huán)境標本（飲用水、空調(diào)系統(tǒng)水、天然水、沉積物等）0.45μm孔徑濾膜過濾，剪碎濾膜放于5mL無菌水中，振蕩3min，制成濃縮樣本高速離心濃縮法直接免疫熒光等快速方法濃縮液、酸處理、熱處理后各取0.1mL用L棒在GVPC上推種第三天起可挑取可疑菌落做鑒定2、環(huán)境標本處理36℃，5%CO2，7~14d環(huán)境標本（飲用水、空調(diào)系統(tǒng)水、天然水、沉積物等）0.45μm303、軍團菌鑒定將可疑菌落次代培養(yǎng)與BCYE-α，BCYE-cys及血平板BCYE-α生長、BCYE-cys及血平板不生長極可能是軍團菌其他的生長模式非軍團菌免疫熒光方法確認血清確認、乳膠凝集試驗確認生化鑒定36℃，5%CO2，7~14d3、軍團菌鑒定將可疑菌落次代培養(yǎng)與BCYE-α，BCYE-31標本濃縮Nucleoporefilterfunnelassemblyforconcentratingwatersamples.水樣的離心●沉積物應重懸●6000r,10min或3000r,30min●離心溫度25~35℃●無菌操作去上清，留大約20mL，不要吸干●沉積物應再重懸●離心樣品涂布軍團菌選擇性平板●如果確定軍團菌CFU＞105，原樣品可可直接接種平板標本濃縮Nucleoporefilterfunnela32濃縮標本的酸處理與熱處理酸處理：加入酸的體積應與濃縮樣本的體積相同，輕晃混勻，處理5min。ReagentsforAcidTreatmentProcedureKCl-HClAcid（pH2.2）A.0.2MKCl(14.9g/Lindistilledwater)B.0.2MHCl(16.7g/Lindistilledwater)1.Mix18partsof(A)with1partof(B)2.Dispenseintobottlesandsterilzebyautoclaving熱處理向無菌試管內(nèi)加入1mL左右的濃縮標本在50±1℃水浴中放置30min。濃縮標本的酸處理與熱處理酸處理：加入酸的體積應與濃縮樣本的體33●一個GVPC平板上可以接種0.1~0.5mL樣品●用無菌的涂抹器均勻的涂抹在培養(yǎng)基表面●用同樣的方法盡快將熱處理與酸處理的樣品接種到第二塊和第三塊培養(yǎng)基上●接種過的培養(yǎng)基靜置至接種物被完全吸收，然后將平板倒置，36℃，2.5%CO2培養(yǎng)2~10天●培養(yǎng)箱內(nèi)應放置盛水裝置保持濕度平板檢查：培養(yǎng)期間，每兩天至少觀察一次，因為軍團菌生長緩慢，可能會被其他菌所掩蓋?？梢绍妶F菌用記號筆標記。選擇培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)●一個GVPC平板上可以接種0.1~0.5mL樣品選擇培養(yǎng)基34●至少從每塊GVPC平板挑選出三個典型菌落，在BCYE-α與BCYE-Cys培養(yǎng)基上同時進行傳代培養(yǎng)●培養(yǎng)2~10天●凡是在BCYE-α生長而BCYE-Cys不生長的菌落可初步認定為軍團菌●血瓊脂可疑代替BCYE-Cys軍團菌傳代培養(yǎng)●至少從每塊GVPC平板挑選出三個典型菌落，在BCYE-α與35

Awatersamplecontaininglegionellaeaftercultureonthefourtypesofmedia.Plate1,BCYEagarwithnumerousnon-LegionellabacteriaandafewLegionellacolonies;Plate2,PCVagarwithnumerousLegionellacoloniesandotherbacteria;Awatersamplecontainingleg36

Plate3,GPCVagarwithLegionella,few,ifanynon-Legionellabacteriaarepresent;Plate4,PCV-withoutcysteineagarwithsomenon-Legionellabacteria;nolegionellaearepresent.

Awatersamplecontaininglegionellaeaftercultureonthefourtypesofmedia.Plate3,GPCVagarwithLegio37Legionellacoloniesasseenthroughadissectingmicroscopeonprimaryisolation(4daysincubation).Notethewhite“cut-glass”appearanceofthecenterofthecolonyandthepurpleiridescencewhichbordersit.Theiridesce