大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射致大鼠腦組織損害的多因素分析

大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射致大鼠腦組織損害的多因素分析

隨著對(duì)重性胰腺（cp）發(fā)病機(jī)制的深入研究和療效的提高，胰腺性腦病已成為臨床癲癇研究的重點(diǎn)之一。雖然胰性腦病的概念早在1941年已由Rothermich等提出,然而半個(gè)多世紀(jì)來(lái)對(duì)胰性腦病的認(rèn)識(shí)仍沒(méi)有明顯進(jìn)展。我們通過(guò)回顧性分析發(fā)現(xiàn)胰酶并非是導(dǎo)致胰性腦病的惟一原因,在胰腺炎病程中存在多種可能導(dǎo)致神經(jīng)精神障礙的原因,如真菌和細(xì)菌感染、水和電解質(zhì)紊亂引發(fā)的高滲透壓環(huán)境等。腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性介質(zhì)被認(rèn)為在SAP發(fā)生、發(fā)展過(guò)程和多臟器功能障礙中起著重要作用。Farkas等報(bào)道SAP時(shí)TNF-α使血腦屏障的通透性增加,提示其與胰性腦病的發(fā)生有關(guān)。目前,對(duì)胰性腦病其他可能病因的認(rèn)識(shí)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大鼠側(cè)腦室分別注射細(xì)胞因子、高滲NaCl溶液、細(xì)菌和真菌懸液,旨在這些病理因素條件下觀(guān)察大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)改變,探討其與胰酶引發(fā)的腦損傷是否存在差別。材料和方法一、細(xì)菌分離和活性清潔級(jí)雄性SD大鼠48只(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重(218.0±33.6)g,隨機(jī)分為6組:胰脂肪酶組、TNF-α組、高滲組、真菌組、細(xì)菌組和對(duì)照組,每組8只大鼠。分別對(duì)各只大鼠側(cè)腦室注射實(shí)驗(yàn)試劑,劑量為10μl/100g體重。胰脂肪酶組大鼠予50U/ml精制胰脂肪酶(Sigma公司)溶液;TNF-α組大鼠予1000pg/mlTNF-α(Sigma公司)溶液;高滲組予10%NaCl;真菌組予0.5麥?zhǔn)蠞舛劝咨钪榫鷳乙?細(xì)菌組予0.5麥?zhǔn)蠞舛却竽c埃希菌懸液;對(duì)照組予0.9%NaCl(NS)。實(shí)驗(yàn)用白色念珠菌、大腸埃希菌為本院細(xì)菌室制備,分別從已孵育18～24h瓊脂平板上挑出單個(gè)菌落,用NS配置濁度為0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?。?shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁飲12h,2.5%戊巴比妥鈉0.1ml/100g腹腔內(nèi)注射麻醉。立體定位儀固定大鼠頭部,以前囟為標(biāo)志,自該點(diǎn)向后1.0mm、旁開(kāi)1.5mm處作為側(cè)腦室穿刺點(diǎn),顱骨鉆孔,直徑為2.0mm;將外徑0.5mm的微量注射器垂直插入側(cè)腦室,深4.0mm。所用試劑經(jīng)手控緩慢恒速注入側(cè)腦室,注入速度為20μl/min。胰脂肪酶組、TNF-α組、高滲組和對(duì)照組大鼠在注射實(shí)驗(yàn)試劑3d后采集腦組織標(biāo)本,真菌組和細(xì)菌組大鼠在7d后采集腦組織標(biāo)本。二、超微病理學(xué)檢查大鼠新鮮大腦標(biāo)本于視神經(jīng)交叉處作冠狀位切片取材。每組中取6只大鼠于光鏡下檢查:標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后石蠟包埋,常規(guī)組織切片,蘇木精-伊紅染色后光鏡觀(guān)察。余2只作透射電鏡檢查:再次戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,迅速開(kāi)胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管,先以100mlNS洗去血液,隨后用4℃含40g/L多聚甲醛的0.1ml/L磷酸緩沖液(pH7.4)先快后慢灌流固定腦組織2h,取大腦組織1mm3數(shù)塊作超微病理學(xué)檢查,2.0%戊二醛固定和1.0%鋨酸PBS后固定(4℃,各2h),梯度乙醇脫水,環(huán)氧丙烷置換兩次,618液包埋浸透,LKBV型切片儀超薄切片,枸櫞酸鉛染色,HitachiH-500型透射電鏡觀(guān)察。三、組織學(xué)評(píng)分采用盲法行光鏡和透射電鏡觀(guān)察,對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘和血管分別作組織學(xué)評(píng)分,評(píng)價(jià)方案見(jiàn)表1。合計(jì)各組評(píng)分得出嚴(yán)重度分級(jí):<6分為輕度;6～9分為中度;9～12分為重度。四、統(tǒng)計(jì)分析用SAS軟件包(6.12)對(duì)組織學(xué)評(píng)分值行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。結(jié)果一、肢體運(yùn)動(dòng)障礙各處理組大鼠多數(shù)表現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、昏睡;部分大鼠的單側(cè)前后肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙,行走蹣跚;少數(shù)表現(xiàn)易激惹。對(duì)照組無(wú)明顯異常行為改變。二、病理組織學(xué)檢測(cè)1.TNF-α組:腦組織在光鏡下可見(jiàn)散在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫,部分毛細(xì)血管擴(kuò)張和水腫(圖1A);電鏡下見(jiàn)部分神經(jīng)元細(xì)胞器水腫,如線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),髓鞘板層結(jié)構(gòu)呈局灶性或散在紊亂。2.胰脂肪酶組及高滲組:上述病變加重,光鏡下可見(jiàn)廣泛神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫,毛細(xì)血管水腫明顯,少量膠質(zhì)細(xì)胞增生;電鏡下見(jiàn)到胞核形態(tài)不規(guī)則、染色質(zhì)邊集,廣泛髓鞘板層結(jié)構(gòu)紊亂(圖1B),毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞。3.真菌組及細(xì)菌組:上述病變嚴(yán)重,表現(xiàn)為光鏡下增生小膠質(zhì)細(xì)胞聚集成團(tuán)(圖1C),呈嗜神經(jīng)元現(xiàn)象,部分可見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)點(diǎn)、片狀出血(圖1D)及腦膿腫;電鏡下見(jiàn)神經(jīng)元核固縮、核碎裂,有時(shí)見(jiàn)到神經(jīng)元凋亡,神經(jīng)纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞,髓鞘板層結(jié)構(gòu)崩解,軸突髓鞘脫失。4.對(duì)照組:未發(fā)現(xiàn)明顯腦組織病變。各組腦組織學(xué)評(píng)分及嚴(yán)重度評(píng)估見(jiàn)表2。討論一、中小型患者胰酶感染的發(fā)病機(jī)制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前瞻性研究已證實(shí)胰酶與胰性腦病的關(guān)系。Estrada等報(bào)道胰性腦病病人腦脊液中脂肪酶異常升高,Vogel將脂肪酶注射入實(shí)驗(yàn)家兔側(cè)腦室復(fù)制出與臨床尸檢相類(lèi)似的病理學(xué)改變。但是,胰酶不足以解釋臨床上所有的胰性腦病。已證實(shí)急性壞死性胰腺炎大鼠早期存在髓鞘結(jié)構(gòu)的損傷,這可能與SAP早期炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放和水、電解質(zhì)紊亂引發(fā)的高滲透壓環(huán)境有關(guān);SAP中、后期真菌和細(xì)菌感染也是其可能原因。腸道起源的革蘭陰性菌是SAP的常見(jiàn)感染菌種,特別是大腸埃希菌所占比例呈逐年上升趨勢(shì)。疾病消耗、大量應(yīng)用廣譜抗生素、腸道功能障礙、肝功能受損和深靜脈營(yíng)養(yǎng)等均使病人容易感染以白色念珠菌為主要類(lèi)型的真菌。二、實(shí)驗(yàn)大鼠血漿胰脂肪酶和tnf-濃度對(duì)大鼠腦梗死超早期感染的影響我們采用Vogel的研究方法,分別將TNF-α、10%NaCl、真菌懸液及細(xì)菌懸液注入大鼠側(cè)腦室,并設(shè)立胰脂肪酶組為陽(yáng)性對(duì)照,NS組為陰性對(duì)照,觀(guān)察腦組織形態(tài)學(xué)改變。研究將胰脂肪酶組和TNF-α組所用的溶液根據(jù)Norman等測(cè)定的壞死性胰腺炎大鼠血漿胰脂肪酶和TNF-α濃度配制。結(jié)果顯示在此濃度條件下二者均導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)元水腫、髓鞘脫失和小膠質(zhì)細(xì)胞增生。高滲組所用的NaCl濃度是臨床輸液較常用的。白色念珠菌和大腸埃希菌是SAP病人真菌和細(xì)菌感染常見(jiàn)的菌種。Vogel在2～3d就觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)家兔腦組織脫髓鞘等改變,因此我們對(duì)胰脂肪酶組、TNF-α組、高滲組大鼠于造模3d后取腦組織檢測(cè)。細(xì)菌組和真菌組大鼠的存活期較長(zhǎng),約2～3周,但在7d左右已表現(xiàn)出明顯的行為學(xué)改變,故在造模7d后取腦組織檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這些取材時(shí)間可反映腦損傷的改變,然而由于取材時(shí)間的不同,結(jié)果之間的比較需慎重,例如感染導(dǎo)致的腦組織損傷最重,但是如果其他各組大鼠在7d觀(guān)察腦組織,尚不能排除達(dá)到相同甚至更嚴(yán)重的病變。三、腦室途徑的致重性在前期研究中,我們通過(guò)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈分別注入細(xì)胞因子、高滲液、細(xì)菌和真菌懸液,證實(shí)上述因素對(duì)腦組織不同程度的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)為去除血腦屏障的影響,直接將損傷因子注入側(cè)腦室。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一因素在經(jīng)側(cè)腦室途徑時(shí)并未表現(xiàn)出比頸內(nèi)動(dòng)脈途徑時(shí)更為嚴(yán)重的損傷,這可能與經(jīng)側(cè)腦室途徑時(shí)所用的劑量較小有關(guān);但不同因素的所致輕重程度的變化趨勢(shì)在兩種途徑下是一致的。細(xì)胞因子、細(xì)菌和真菌感染以及高滲透壓環(huán)境都會(huì)造成與胰酶相類(lèi)似的腦組織損傷。不同病理因素所導(dǎo)致的腦組織損傷嚴(yán)重程度有差異,細(xì)菌