小柴胡湯對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫相關(guān)因子的影響

小柴胡湯對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫相關(guān)因子的影響

小柴胡湯源于東漢張仲景所著的《傷寒》和《錢荒本要義》。這是少陽和解少陽的代表湯。由柴胡、黃芩、半夏、人參、甘草、生姜、大棗7味藥組成,是和解少陽的代表方劑,臨床應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,小柴胡湯具有免疫調(diào)節(jié)功能。本研究以環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CY)腹腔注射制備免疫抑制小鼠模型,并用生理鹽水作對照,觀察小柴胡湯及其劑量變化對免疫抑制小鼠免疫相關(guān)因子TNF-α、IL-2、IL-6的影響。旨在證實小柴胡湯對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用并初步揭示其作用機制,并為拓展小柴胡湯的臨床運用范圍提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1小鼠飼養(yǎng)環(huán)境健康昆明鼠90只,雌雄各半,體重(20±2)g,6~8周齡,由青島市實驗動物和動物實驗中心提供,許可證號:SCXK(魯)20090007;小鼠常規(guī)飼養(yǎng)、自由攝食、飲水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度18~22℃,濕度40~70%,自然晝夜節(jié)律光照。小鼠經(jīng)常規(guī)飼養(yǎng)7d后,按照隨機分組的原則分為5組,每組18只,雌雄分籠飼養(yǎng),每籠6只。1.2主試劑和設(shè)備1.2.1配制0.2mol溶液注射用環(huán)磷酰胺:0.2g/支,批號:H32020857,由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。用蒸餾水溶解,稀釋成2mg/mL。ELISA試劑盒:由武漢博士德生物工程有限公司提供,TNF-α(貨號:EK0527),IL-2(貨號:EK0398),IL-6(貨號:EK0411)。1.2.2儀器、設(shè)備電子天平(JA1003B型,上海越平科學(xué)儀器有限公司);恒溫水浴箱(SHZ-B型,上海躍進醫(yī)療器械廠);臺式低速離心機(80-2型,上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術(shù)器械廠);超凈工作臺(SW-CJ-1FD型,蘇州凈化設(shè)備有限公司);酶標(biāo)分析儀(RT-6000型,美國Rayto雷杜公司);微量移液器及相應(yīng)量程吸頭等;本實驗在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實驗室完成。1.3實驗方法1.3.1味中藥的預(yù)處理小柴胡湯的組成為柴胡20g,黃芩10g,半夏10g,人參10g,炙甘草6g,生姜10g,大棗10g。將上述7味中藥,以8倍量蒸餾水浸泡30min,加熱保持微沸30min,過濾;殘渣加6倍量蒸餾水,微沸30min,過濾,合并2次濾液,混合后濾液干燥濃縮至100mL,即低劑量小柴胡湯(0.76g/mL);以類似方法濃縮熬制中劑量小柴胡湯(1.52g/mL)、高劑量小柴胡湯(3.04g/mL),4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.2環(huán)磷酰胺的注射正常對照組腹腔注射生理鹽水1mL/d,同時用生理鹽水經(jīng)食道灌胃0.3mL/d,連續(xù)7d;模型對照組用環(huán)磷酰胺腹腔注射(100mg/(kg·d)),同時用生理鹽水經(jīng)食道灌胃0.3mL/d,連續(xù)7d;小柴胡湯低、中、高劑量組分別用環(huán)磷酰胺腹腔注射(100mg/(kg·d)),同時分別用不同劑量的小柴胡湯灌胃0.3mL/d(劑量為10g/kg、20g/kg、40g/kg),連續(xù)7d。1.4血清離心分離末次給藥后30min,稱量體重,摘眼球取血2mL,迅速低溫離心分離血清(4℃,3000r/min,10min),標(biāo)記好后置-20℃保存?zhèn)溆?。分離胸腺并測定重量,計算胸腺指數(shù)。1.5elisa檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-6含量檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法,操作步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)。1.6統(tǒng)計方法用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,結(jié)果以(ue0af±s)表示,以t檢驗分析組間差異,顯著性水平α=0.05。2結(jié)果2.1酰胺前急性毒性試驗正常對照組小鼠實驗前后無明顯變化,未出現(xiàn)小鼠死亡。模型對照組小鼠在應(yīng)用環(huán)磷酰胺后,出現(xiàn)精神萎靡、活動量下降及攝食量減少,逐漸出現(xiàn)毛色變暗,體型消瘦等表現(xiàn),有3只小鼠死亡。小柴胡湯低、中、高劑量組相對于正常對照組小鼠活動量及進食量稍微減少,體型無明顯消瘦;小柴胡湯低、高劑量組各有1只小鼠死亡。2.2明環(huán)磷酰胺對小鼠免疫功能的影響從實驗結(jié)果可見,與正常對照組比較,模型對照組小鼠的胸腺指數(shù)有明顯降低(P﹤0.01),說明環(huán)磷酰胺可使小鼠胸腺明顯萎縮,免疫功能下降,使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)。與模型對照組相比,小柴胡湯高、中、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)均顯著升高(P﹤0.01),但與正常對照組小鼠比較,胸腺指數(shù)無明顯差異(P﹥0.05);表明小柴胡湯可在一定程度保護免疫抑制小鼠的免疫器官及功能,見表1。2.3小柴胡湯對小鼠tnf-的影響從實驗結(jié)果可見,與正常對照組比較,模型對照組、小柴胡湯低、中、高劑量組小鼠TNF-α均有明顯降低(P﹤0.01-0.05);小柴胡湯低、中劑量組與模型對照組比較,小鼠TNF-α無明顯差異(P﹥0.05);小柴胡湯高劑量組與模型對照組比較,小鼠TNF-α有顯著升高(P﹤0.05);小柴胡湯低、中、高劑量組之間比較,小柴胡湯高劑量組比小柴胡湯低劑量組小鼠TNF-α有顯著升高(P﹤0.05),見表2。2.4小柴胡湯高、中、低劑量對小鼠il-2的影響從實驗結(jié)果可見,與正常對照組比較,模型對照組、小柴胡湯低劑量組小鼠IL-2有明顯降低(P﹤0.01,P﹤0.05),小柴胡湯高、中劑量組小鼠IL-2無明顯差異(P﹥0.05);與模型對照組相比,小柴胡湯高、中、低劑量組小鼠IL-2均有顯著升高(P﹤0.01);與小柴胡湯低劑量組比較,小柴胡湯高、中劑量組小鼠IL-2均有顯著升高(P﹤0.01,P﹤0.05);但小柴胡湯高、中劑量組之間無明顯差異(P﹥0.05),見表3。2.5小柴胡湯對小鼠il-6的影響從實驗結(jié)果可見,與正常對照組比較,模型對照組、小柴胡湯低、中、高劑量組小鼠IL-6均有明顯降低(P﹤0.01-0.05);與模型對照組相比,小柴胡湯低劑量組小鼠IL-6無明顯差異(P﹥0.05),小柴胡湯高、中劑量組小鼠IL-6均有顯著升高(P﹤0.01);與小柴胡湯低劑量組比較,小柴胡湯高、中劑量組小鼠IL-6均有顯著升高(P﹤0.01);但小柴胡湯高、中劑量組之間無明顯差異(P﹥0.05),見表4。3免疫抑制作用環(huán)磷酰胺能降低小鼠血清IL-2、IL-6及TNF-α的水平;小柴胡湯能夠拮抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用,對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)有明顯的提高作用;能夠升高免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-6及TNF-α的水平,其中小柴胡湯中、高劑量組效果更顯著;小柴胡湯在一定程度上能夠調(diào)節(jié)機體的免疫功能。4小柴胡湯對四氯化碳的影響環(huán)磷酰胺作為一種細(xì)胞毒化療藥物,同時也屬于烷化劑類免疫抑制劑,其作用主要是破壞DNA的結(jié)構(gòu),從而阻斷其復(fù)制,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。臨床上主要用于多種腫瘤及自身免疫性疾病的治療,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時,可損傷自身免疫細(xì)胞,造成機體免疫功能的低下。而在免疫毒理學(xué)中,環(huán)磷酰胺是制備免疫抑制模型的常用藥物。對于健康小鼠,經(jīng)皮下或腹腔注射環(huán)磷酰胺80~150mg/kg,5d后小鼠免疫功能顯著下降。本研究選用環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑,所用劑量為100mg/(kg·d),結(jié)果可見環(huán)磷酰胺模型組和正常對照組小鼠實驗指標(biāo)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,說明成功制備免疫抑制動物模型。謝斌等通過小柴胡湯急性毒性實驗(改進寇氏法)發(fā)現(xiàn)小柴胡湯及加味小柴胡湯80g/(kg·d)劑量可能對小鼠影響較大,而40g/(kg·d)劑量下對小鼠可能影響較小。邵鴻娥等通過實驗發(fā)現(xiàn)小柴胡湯加味水煎濃縮劑20、45g/kg可以降低四氯化碳引起的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高,具有保護化學(xué)性肝損傷作用。故本研究所用小柴胡湯劑量均在40g/kg/d以下,小柴胡湯低、中、高劑量[10、20、40g/(kg·d)]相當(dāng)臨床成人每日常用量的10、20、40倍。模型對照組有3只小鼠死亡;小柴胡湯低、高劑量組各有1只小鼠死亡。究其原因與環(huán)磷酰胺的毒性、實驗操作不當(dāng)、小鼠個體耐受性差等多因素有關(guān)。胸腺是機體重要的免疫器官,胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素,主要參與細(xì)胞免疫。其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。該實驗發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能顯著提高小鼠胸腺指數(shù),對細(xì)胞免疫有增強作用。Mosmann等依據(jù)小鼠分泌的細(xì)胞因子譜不同首次將Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩個功能不同的獨立亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),在誘發(fā)器官特異性自身免疫病,器官移植排斥反應(yīng)和抗感染免疫中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13,主要調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng),在誘發(fā)過敏反應(yīng)中起著決定性的作用。IL-2在體內(nèi)通過與免疫細(xì)胞表達(dá)的特異性IL-2R結(jié)合,傳導(dǎo)生物信號而發(fā)揮作用。IL-2均具有促進T細(xì)胞增殖、增強殺傷T細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性等廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,IL-2水平的高低是機體細(xì)胞免疫的重要標(biāo)志。IL-6是由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子,具有廣泛的生物學(xué)活性,主要包括:促進B細(xì)胞分化,刺激B細(xì)胞分泌免疫球蛋白;促進植物血凝素(PHA)或刀豆球蛋白(ConA)激活的T細(xì)胞增殖,刺激未成熟的胸腺細(xì)胞分化為成熟的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL);擴大自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷能力;誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白;具有典型的干擾素樣活性,啟動抗病毒及抗腫瘤作用等。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性細(xì)胞因子,具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,增強T細(xì)胞、B細(xì)胞對抗原和絲