熒光傳感微球材料的研究現(xiàn)狀與展望

熒光傳感微球材料的研究現(xiàn)狀與展望

盡管廣相廣相廣播儀的應(yīng)用靈活，并且具有很高的靈敏度和選擇性，因此受到人們的高度重視。然而，廣相廣播儀的缺點(diǎn)也限制了其應(yīng)用，因?yàn)楹茈y完全組件化，只能一次性使用，并且容易污染試驗(yàn)系統(tǒng)。另一方面，熒光薄膜傳感器和熒光微球傳感器基本上克服了這些缺點(diǎn)，近年來引起了人們的廣泛關(guān)注。例如，reinhoudt等人、蝙蝠、swag等人、模型等人和其他工作圍繞著熒光膜傳感器進(jìn)行了大量工作，并取得了令人興奮的成果。然而，由于透射性和基本單元效應(yīng)，溶液中使用的廣受歡迎微球傳感器的靈敏度一般不高，這限制了實(shí)際應(yīng)用。與固體微球相比，微-納米級(jí)微球的表面更大。作為廣觀傳感器的載體，它可以有效地提高傳感器分子的固定量，改善傳感器材料的滲透性，顯著提高傳感器的靈敏度。此外，當(dāng)以超順磁性微球?yàn)檩d體時(shí)，這些傳感器可以很容易地分離、重復(fù)使用，這不僅使人們重視膜廣觀傳感器的研究，而且非常重視微球傳感器的研究。正如膜傳感器一樣，微球傳感器通常以小分枝作為傳感器活動(dòng)的分子，這主要是因?yàn)闊晒夥椒ň哂懈叨鹊臐B透性，并且可以收集信息（如熒光強(qiáng)度、熒光光譜形狀、各向異性、熒光壽命等）。考慮到熒光微傳感器的研究重要性，本文簡要介紹了闡明微球傳感器的研究進(jìn)展情況。1熒光傳感微球由于二氧化硅微球制備方法簡單,價(jià)格低廉,易于表面修飾,使其成為理想的微球傳感器支撐材料.Lin等以MCM-41型介孔SiO2微球?yàn)榛|(zhì),用鄰苯二甲醛對(duì)其巰基化表面進(jìn)行修飾生成OPTA(o-phthalichemithioacetal),利用OPTA與含氨基化合物反應(yīng)后生成具有強(qiáng)熒光的異吲哚這一性質(zhì),合成了該類化合物的傳感微球材料M1(圖1).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),M1對(duì)多巴胺的響應(yīng)速度比對(duì)氨基葡萄糖的響應(yīng)速度快至少10倍,利用這一動(dòng)力學(xué)差異可以分別測(cè)定生物活性分子多巴胺和氨基葡萄糖.值得注意的是,多巴胺分子和氨基葡萄糖分子大小相近,在均相溶液中與OPTA的反應(yīng)活性也基本相同,因此,這種響應(yīng)差異可能不是來自于載體孔道的屏蔽作用,而是由于含有大量羥基的氨基葡萄糖與Ml內(nèi)壁羥基的強(qiáng)偶極作用抑制了其在載體孔道中的擴(kuò)散速度,因此M1對(duì)其響應(yīng)較慢.多巴胺和谷氨酸是兩種必不可少的神經(jīng)遞質(zhì),在生命過程中發(fā)揮著重要的作用,由于兩者在神經(jīng)細(xì)胞中同時(shí)存在,難以對(duì)其分別測(cè)定.Lin等以聚乳酸(PLA)包覆傳感微球M1(參見圖1),合成了能夠區(qū)分細(xì)胞外多巴胺和谷氨酸的傳感微球.實(shí)驗(yàn)表明:多巴胺可以快速穿過PLA層并與OPTA反應(yīng),產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào),而谷氨酸和酪氨酸等難以通過PLA層,與OPTA反應(yīng)困難,熒光增敏現(xiàn)象出現(xiàn)較慢.在這一區(qū)分測(cè)定過程中,PLA膜層發(fā)揮了“門衛(wèi)”作用(gate-keepingeffect).他們將這種“門衛(wèi)”作用歸因于PLA與谷氨酸和酪氨酸等之間較強(qiáng)的相互作用,這種作用的存在也得到了以裸露M1所進(jìn)行的對(duì)比實(shí)驗(yàn)的證明.Tan等設(shè)計(jì)合成了一種能檢測(cè)牛肉沫中大腸桿菌的SiO2納米傳感微球.他們將熒光染料釕聯(lián)吡啶(RuBpy)摻雜在SiO2納米顆粒中,然后將能與大腸桿菌表面抗原特異作用的抗體化學(xué)結(jié)合在其表面,通過觀察體系熒光變化就可以檢測(cè)大腸桿菌.這種微球傳感器利用信號(hào)放大效應(yīng)克服了傳統(tǒng)細(xì)菌擴(kuò)增法耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn),使得大腸桿菌的檢測(cè)變得簡單易行.在這種方法中,一個(gè)細(xì)菌可以結(jié)合數(shù)千個(gè)納米顆粒,而一個(gè)納米顆粒又可以攜帶數(shù)千個(gè)熒光活性分子,這樣信號(hào)可以成千上萬倍地?cái)U(kuò)大.除了這些優(yōu)點(diǎn)之外,在微球傳感器表面還可以同時(shí)結(jié)合多種抗體,使得多種細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)成為可能.雖然利用熒光增強(qiáng)作用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定已經(jīng)成為蛋白定量的通用方法,但這種方法存在的光漂白和信號(hào)弱等缺點(diǎn)一直未能很好解決.以半胱氨酸修飾納米ZnS顆?？梢缘玫剿苄詮?fù)合ZnS微球材料,該熒光微球可以用作蛋白質(zhì)的檢測(cè)探針.以同步掃描技術(shù)(Δλ=190nm)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)存在時(shí),體系在267nm處出現(xiàn)強(qiáng)熒光,利用這一信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè).除此之外,該法還具有檢測(cè)無毒、檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn).相對(duì)于熒光增敏,猝滅型熒光微球傳感器使用得更多.多年來,MIT的Swager等一直致力于微痕量硝基芳烴類化合物的熒光檢測(cè),他們合成了一系列類似于圖2所示的共軛熒光聚合物,據(jù)稱這類熒光聚合物具有分子導(dǎo)線或“一點(diǎn)接觸,多點(diǎn)響應(yīng)”效應(yīng),因此熒光量子產(chǎn)率高,對(duì)猝滅劑存在敏感,用其加工制備的傳感器優(yōu)點(diǎn)突出.以這類共軛熒光聚合物為活性成分的薄膜傳感器或微球傳感器的傳感性能與待檢測(cè)物質(zhì)在涂層中的通透性關(guān)系極大,因此在設(shè)計(jì)合成這類聚合物時(shí)要在其側(cè)鏈上連接大基團(tuán),防止主鏈相互聚集,在涂層中形成分子通道,提高相關(guān)傳感器的傳感特性.例如,將這種聚合物沉積在能吸附溶液或土壤中硝基芳烴類化合物的聚合物微球上,得到能夠探測(cè)微痕量硝基芳烴類化合物的熒光傳感微球材料,這類微球被稱之為“智能沙子”(smartsand)(圖3).王柯敏等也利用分子導(dǎo)線聚合物的信號(hào)放大效應(yīng),根據(jù)氰離子加入前后聚合物熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化較好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)氰離子的選擇性檢測(cè).多巴胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞方面扮演十分重要的角色,它的濃度與帕金森、神經(jīng)分裂等重要疾病密切關(guān)聯(lián),因此對(duì)其精確檢測(cè)意義重大.Raymo等報(bào)道了一種多巴胺的快速可靠熒光探針檢測(cè)法,他們用硅烷化試劑預(yù)先處理SiO2微球,然后使其與熒光活性陽離子2,7-二氮雜芘的衍生物結(jié)合,得到了一種熒光傳感微球材料(圖4),缺電子的熒光分子與富電子的多巴胺分子結(jié)合導(dǎo)致微球熒光急劇猝滅,從而顯示多巴胺的存在.Rosenzweig等將光澤精(一種能夠特異識(shí)別鹵素離子的熒光染料分子)標(biāo)記的磷脂膜共價(jià)固定于聚苯乙烯微球表面,制備了氯離子熒光傳感微球材料,利用此熒光傳感微球可以在線檢測(cè)人體血液中氯離子濃度.Kopelman等將一種熒光素衍生物共價(jià)結(jié)合于金膠體顆粒表面,制備了對(duì)NO特異傳感的熒光微球材料.NO的吸附使得熒光素在微球表面的取向發(fā)生變化,從而微球熒光強(qiáng)度降低,據(jù)此可以測(cè)定白鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的NO含量.光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photo-inducedelectrontransfer,PET)是一種重要的光物理過程,也是熒光猝滅的一種特殊形式.將PET過程用于傳感微球設(shè)計(jì),可以進(jìn)一步豐富熒光傳感微球的設(shè)計(jì)思路.Ayadim等用末端為氨基的硅烷化試劑處理SiO2微球,然后將其再與氯甲基蒽反應(yīng),得到一種對(duì)pH敏感的熒光微球材料.當(dāng)該微球處于酸性環(huán)境中時(shí),因質(zhì)子化封閉了連接臂N原子上的孤對(duì)電子,使得導(dǎo)致熒光猝滅的PET過程無法發(fā)生,體系熒光增強(qiáng).相反,在堿性環(huán)境中,N原子上孤對(duì)電子可以參與PET過程,使體系熒光猝滅.這樣根據(jù)體系熒光強(qiáng)度的變化就可以實(shí)現(xiàn)pH的測(cè)定.更為有趣的是,當(dāng)將蒽以較高密度固定到微球表面時(shí),微球?qū)θ芤簆H變化不再敏感,而對(duì)有機(jī)溶劑中微量水的存在卻異常敏感,利用這一現(xiàn)象可以實(shí)現(xiàn)非水體系中痕量水的半定量測(cè)定.王輝等利用溶膠-凝膠法制得了納米SiO2微球,利用表面反應(yīng)將萘化學(xué)固定于微球表面(如圖5),發(fā)展了一種超靈敏銅離子熒光微球傳感器.綜上所述,基于微球的熒光強(qiáng)度變化的熒光傳感器具有原理簡單、現(xiàn)象易于觀察等優(yōu)點(diǎn),在實(shí)際工作中易于應(yīng)用.但對(duì)許多復(fù)雜體系而言,這類熒光微球傳感器因抗干擾能力弱而難以應(yīng)用,因此,出現(xiàn)了比例型熒光微球傳感器.2熒光傳感微球傳感器Montalti等將丹磺酰共價(jià)結(jié)合于SiO2微球表面(圖6),以微酸性溶液處理所得微球,得到表面結(jié)合丹磺酰部分質(zhì)子化的微球材料.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),質(zhì)子化的丹磺酰光物理行為與未質(zhì)子化的丹磺酰很不相同,兩者可以被選擇性地激發(fā).實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),因參與能量轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移,這兩種形態(tài)之間可以發(fā)生相互作用.質(zhì)子化強(qiáng)烈猝滅丹磺酰修飾SiO2微球的兩種熒光發(fā)射,這一過程與溶劑極性關(guān)系極為密切,據(jù)此可以對(duì)微球微環(huán)境極性進(jìn)行靈敏檢測(cè).作者預(yù)期這一發(fā)現(xiàn)將在設(shè)計(jì)制備新型熒光傳感材料方面獲得應(yīng)用.Bakker等將熒光手段與陰離子-質(zhì)子共萃取機(jī)理相結(jié)合,設(shè)計(jì)制備了以塑化聚氯乙烯微球?yàn)檩d體,尼羅蘭衍生物(ETH5294,圖7)為傳感元素的兩類對(duì)特定離子具有選擇性識(shí)別能力的熒光傳感微球材料.在第一類微球材料中,微球表面只有尼羅蘭ETH5294.利用質(zhì)子化ETH5294及其非質(zhì)子化ETH5294發(fā)射光譜位置的差異,依靠兩個(gè)熒光發(fā)射相對(duì)強(qiáng)度的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某些陰離子的選擇性識(shí)別.該微球?qū)﹃庪x子的選擇性取決于被萃取陰離子的水合焓.在第二類微球材料中,微球表面除了化學(xué)結(jié)合ETH5294外,還擔(dān)載有能夠特異識(shí)別鉀離子、鈉離子和鉛離子等的離子載體,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種金屬陽離子的選擇性識(shí)別.以這些熒光傳感微球?yàn)闄z測(cè)試劑,結(jié)合流動(dòng)細(xì)胞技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞中有關(guān)離子進(jìn)行快速分析.Cai等制備了溫度響應(yīng)型熒光微球傳感器.這種熒光傳感微球的化學(xué)本質(zhì)是鉺摻雜氟化玻璃微球,這種微球具有上轉(zhuǎn)換熒光性質(zhì).其中位于522和546nm的熒光分別來自鉺的4S3/2和2H1/2激發(fā)態(tài).以兩者強(qiáng)度比值為參量,可以在150—850K范圍內(nèi)對(duì)溫度進(jìn)行比較精確的測(cè)定,分辨率可達(dá)lK.相對(duì)于其他玻璃或光纖溫度傳感器,這種微球溫度傳感器具有容易制備、成本低、測(cè)量簡單、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn),如果調(diào)整微球尺寸,還可以進(jìn)一步擴(kuò)展微球的溫度測(cè)量范圍.Rotello等將2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶和芘同時(shí)共價(jià)結(jié)合于金膠體顆粒表面,實(shí)現(xiàn)了對(duì)核黃素的選擇性識(shí)別.2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶有多個(gè)氫鍵結(jié)合位點(diǎn),可以和核黃素形成氫鍵,而芘與核黃素可以發(fā)生π-π相互作用,這兩種作用的存在使得膠體金顆粒表面對(duì)核黃素具有特異結(jié)合能力(圖8).除上述單熒光物種標(biāo)記傳感微球外,將兩種熒光物種同時(shí)標(biāo)記于微球表面,利用被檢測(cè)物質(zhì)加入前后兩者熒光發(fā)射相對(duì)強(qiáng)度的變化,也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)組分的檢測(cè).由Kopelman等提出的生物定位包埋探針(probeencapsulatedbybiologicallylocalizedembedding,PEBBLE)技術(shù)備受人們重視,這種技術(shù)的核心是用熒光染料對(duì)納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記,根據(jù)熒光染料與被測(cè)物質(zhì)結(jié)合前后熒光強(qiáng)度等的變化來檢測(cè)被測(cè)物質(zhì)的存在.利用這種技術(shù)可以測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的pH、細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度等.除此之外,這種技術(shù)還具有選擇性高、可逆性好、響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn).在此基礎(chǔ)上,Kopelnan等還設(shè)計(jì)制備了對(duì)活細(xì)胞內(nèi)鎂離子選擇性傳感的熒光微球傳感器,其中標(biāo)記所用熒光試劑為香豆素343和Texas紅.選擇香豆素343的原因在于其可以選擇性結(jié)合鎂離子,而Texas紅僅被用作參考熒光物質(zhì).實(shí)驗(yàn)表明,鈣離子、鈉離子、鉀離子等的存在均不干擾測(cè)定.與自由態(tài)熒光相比較,微球熒光基本不受非特異性吸附蛋白的影響.此外,這種熒光微球傳感器表面還可以鍵合諸如配體、特異蛋白、DNA等多種生物分子,這樣根據(jù)測(cè)定對(duì)象可以選擇合適的生物分子對(duì)其表面實(shí)施修飾,得到對(duì)特定生物物質(zhì)敏感的熒光傳感微球.不難看出,這類熒光微球傳感器在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè),特別是在單個(gè)活細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中將獲得重要應(yīng)用,顯示出很好的應(yīng)用前景.巨噬細(xì)胞對(duì)病毒或細(xì)菌的吞噬作用是機(jī)體對(duì)外來感染的免疫應(yīng)答.吞噬作用發(fā)生后細(xì)胞會(huì)分泌溶菌酶、膠原酶、酸性水解酶等,溶菌酶的pH值可作為其活性標(biāo)志,同時(shí)亦表現(xiàn)出吞噬細(xì)胞的活性.Rossenzweig等將pH敏感染料Oregon綠和非pH敏感染料Texas紅共價(jià)結(jié)合到帶有大量氨基的亞微米聚苯乙烯微球表面,制備了對(duì)白鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)溶菌酶的pH敏感的熒光傳感微球,利用這種微球研究了氯喹對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶菌酶分泌的影響.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨pH升高,Oregon綠與Texas紅的熒光強(qiáng)度比值增大,利用這一比值作為參量實(shí)施測(cè)定較之單用Oregon綠要好得多,可以有效補(bǔ)償儀器漂移、傳感器位置移動(dòng)以及其他因素所引起的測(cè)定誤差.此類熒光傳感微球的缺點(diǎn)在于熒光試劑暴露于測(cè)試環(huán)境中,易于受到干擾.當(dāng)氯喹濃度達(dá)到100μmol/L以后,測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大偏差.為此,Rosenzweig等將熒光素和四甲基羅丹明雙標(biāo)記的磷脂共價(jià)結(jié)合于帶有大量羧基的聚苯乙烯微球表面,制得了對(duì)溶菌酶pH敏感的新的熒光微球材料.在這一材料中,四甲基羅丹明為參考熒光物質(zhì),熒光素則為對(duì)pH敏感的熒光試劑,微球的pH響應(yīng)范圍為5.5—7,最小分辨率可達(dá)0.1個(gè)pH單位.由于許多蛋白質(zhì)分子的直徑、細(xì)胞膜的厚度和多亞基蛋白質(zhì)位點(diǎn)間的距離多在2—6nm之間,與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的特征Frster距離相近,因此FRET技術(shù)在生物物理研究中獲得了廣泛應(yīng)用.Rosenzweig等利用FRET技術(shù)和碳水化合物對(duì)凝集素分子的特異選擇性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)碳水化合物及糖蛋白的傳感.具體過程是將熒光素標(biāo)記外源凝集素分子吸附在聚苯乙烯微球表面作為給體,以Texas紅標(biāo)記葡聚糖分子為受體,當(dāng)體系中存在碳水化合物或糖蛋白時(shí),其與外源凝集素分子結(jié)合,占據(jù)葡聚糖分子的結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致FRET效率降低.根據(jù)碳水化合物與糖蛋白結(jié)合能力的不同,可以定量區(qū)分這兩類物質(zhì)在溶液中的濃度.Steemers等利用FRET原理設(shè)計(jì)了一種分子信標(biāo),并將其連接到光纖陣列斷面(圖9),用于檢測(cè)特定寡核苷酸序列.在這種分子信標(biāo)的末端連接著熒光物種F,另一端連接有猝滅劑分子Q,連接臂則為一段具有特定序列的寡核苷酸,連接臂內(nèi)部的寡核苷酸通過配對(duì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),當(dāng)沒有目標(biāo)DNA分子時(shí),F與Q相互靠近,F的熒光被猝滅,體系無熒光信號(hào)或熒光信號(hào)很弱;當(dāng)出現(xiàn)目標(biāo)分子時(shí),發(fā)夾結(jié)構(gòu)展開,F與Q相對(duì)遠(yuǎn)離,體系發(fā)出熒光.很顯然,與強(qiáng)度變化型熒光微球傳感器不同,比例型熒光微球傳感器是以兩種熒光物種的熒光強(qiáng)度之比或同一熒光物種的兩個(gè)不同熒光發(fā)射的強(qiáng)度之比作為參量進(jìn)行檢測(cè),這樣不僅可以減小測(cè)定誤差,增加測(cè)量的準(zhǔn)確性,而且可以有效避開環(huán)境因素干擾,拓寬微球類熒光傳感器的實(shí)際應(yīng)用.3光纖傳感微球?qū)晒鈧鞲形⑶蚍稚⒂诖郎y(cè)溶液中,根據(jù)微球熒光信號(hào)的變化檢測(cè)待分析物是最常用的熒光傳感微球使用方法.例如,Swager等研制的“智能沙子”就以這種方法獲得應(yīng)用.然而,如果不解決熒光微球傳感器的重復(fù)使用問題,它就很難獲得實(shí)際應(yīng)用.基于這一考慮,人們提出以超順磁性微球作為熒光活性物質(zhì)載體制備熒光傳感微球.例如,Qiu等以包覆有苯乙烯和馬來酸酐共聚物的超順磁性Fe3O4/鄰苯二甲酸銪熒光微球?yàn)檩d體,將肝磷脂共價(jià)結(jié)合在其表面,不但解決了傳感微球的分離和重復(fù)使用問題,而且還提高了微球的生物相容性,擴(kuò)展了傳感微球的使用范圍.除了以上述途徑解決熒光傳感微球的分離和重復(fù)使用問題外,通過集成化,也可以解決這一問題.事實(shí)上,集成化還可以使此類熒光傳感微球更加易于器件化和儀器化.將光纖作為微球材料集成化的載體,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定成分的遠(yuǎn)距離傳感.Walt等利用光纖將具有不同傳感性能的微球材料集成化,依靠熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品中多組分的同時(shí)檢測(cè).他們將纖維末端浸于HF溶液中,利用光纖芯和包皮材料對(duì)HF反應(yīng)的不同在光纖斷面上形成微井(microwell),然后將已經(jīng)預(yù)先功能化的微球隨機(jī)置于微井中,組裝成具有如圖10所示的具有特殊結(jié)構(gòu)的光纖熒光微球傳感器.很顯然,這種光纖熒光微球傳感器的充分使用有賴于對(duì)不同類型熒光傳感微球的有效識(shí)別,以使熒光測(cè)量系統(tǒng)能夠辨別它們.為了實(shí)現(xiàn)對(duì)不同傳感微球的編碼,通常以菁染料DiIC(indodicarbocyanine)和Texas紅染料TRC(Texasredcadaverine)對(duì)相關(guān)微球進(jìn)行雙標(biāo)記,這是由于兩者可同時(shí)被577nm光源激發(fā),并在670和610nm處形成各自的最大發(fā)射峰.這樣,以不同比例的DiIC和TRC標(biāo)記不同種類傳感微球,就可以達(dá)到對(duì)這些微球進(jìn)行編碼識(shí)別的目的.以雙標(biāo)記微球?yàn)檩d體,對(duì)其表面進(jìn)行修飾就可以得到對(duì)不同待分析物敏感的熒光傳感微球材料.以這些傳感微球?yàn)闄z測(cè)材料,利用特殊的檢測(cè)儀器或系統(tǒng)就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中多種成分的同時(shí)測(cè)定.事實(shí)上,利用活細(xì)胞對(duì)pH,O2以及CO2敏感的性質(zhì)設(shè)計(jì)制備的光纖熒光微球傳感器已經(jīng)成功用于對(duì)細(xì)胞新陳代謝過程的檢測(cè),這種檢測(cè)具有快速、可重復(fù)和非侵害性等特點(diǎn).實(shí)際