曼陀羅種子休眠機(jī)理及破眠方法研究

曼陀羅種子休眠機(jī)理及破眠方法研究

曼陀羅是茄子科的一種植物。它的花、葉和種子可以單獨(dú)藥物。它的味道很熱。它具有哮喘、止咳、解痙、鎮(zhèn)痛、麻醉等功效。曼陀羅的主要活性成分為莨菪堿、東莨菪堿和阿托品,其在臨床上用于多種疾病的治療。曼陀羅還有殺鼠、殺蟲(chóng)、殺菌、除草等農(nóng)用生物活性,在植保領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。曼陀羅用種子繁殖,但其種子存在顯著的休眠性,且有發(fā)芽率低、出苗不整齊等特性,給其研究和生產(chǎn)帶來(lái)了困難。國(guó)內(nèi)外對(duì)曼陀羅種子休眠機(jī)理與破眠方法的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道,本試驗(yàn)對(duì)曼陀羅種子休眠機(jī)理進(jìn)行研究,并利用物理、化學(xué)方法處理曼陀羅種子,以打破其種子休眠,提高種子發(fā)芽率,為曼陀羅種質(zhì)資源保護(hù)及人工種植提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1曼陀羅種子的采集供試曼陀羅種子于2009年9月采自西北農(nóng)林科技大學(xué)校園生長(zhǎng)的野生曼陀羅。果實(shí)成熟到果皮開(kāi)裂時(shí)采摘,取出種子,室內(nèi)晾干備用。本文提及的新采收曼陀羅種子指采收后晾干了1周的種子。1.2方法1.2.1營(yíng)養(yǎng)組織胚乳的染色用TTC法測(cè)定新采收的曼陀羅種子生活力:室溫浸種24h后剝?nèi)シN皮縱切種仁(胚乳和胚的總稱),用0.5%TTC溶液于30℃黑暗條件下顯色12h,統(tǒng)計(jì)顯色結(jié)果,胚的主要結(jié)構(gòu)以及營(yíng)養(yǎng)組織(胚乳)染成有光澤的鮮紅色且組織狀態(tài)正常的為有活力的種子;胚的主要結(jié)構(gòu)局部染色或營(yíng)養(yǎng)組織不染色、組織軟化的為不正常種子;完全不染色或染成淡紅或灰白色、組織異常、腐爛的為死亡種子。試驗(yàn)重復(fù)4次,每重復(fù)50粒種子。計(jì)算公式:種子生活力百分比=(有活力的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%發(fā)芽試驗(yàn):發(fā)芽床為鋪有濾紙培養(yǎng)皿,25℃黑暗培養(yǎng),第7天和第15天時(shí)分別統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù),每皿50粒種子,4次重復(fù)。計(jì)算公式:發(fā)芽勢(shì)=(第7天時(shí)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%發(fā)芽率=(第15天時(shí)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%1.2.2種子表面水分(2)種皮透水性測(cè)定參照楊文權(quán)的方法測(cè)定種子吸水率:取曼陀羅種子2份,各100粒,一份不經(jīng)任何處理,另一份經(jīng)10%NaOH溶液腐蝕種皮90min,分別放入50mL小燒杯中,加蒸餾水浸泡,于1、3、6、12、18、24、36、48、72h取出種子,用吸水紙吸干種子表面水分,稱重,試驗(yàn)重復(fù)3次。吸水率計(jì)算公式:吸水率=[(浸種后重量-浸種前重量)/浸種前重量]×100%(3)種皮透氣性測(cè)定取曼陀羅種子,參照王貴余的方法,用0.05%~1%H2O2于室溫浸種12h,使種皮受到輕度腐蝕,用清水沖洗后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),對(duì)照為蒸餾水浸種12h。1.2.3發(fā)芽試驗(yàn)方法(2)GA3浸種將采收1周后的曼陀羅種子去皮后分別用50、100、150、200、250、300mg/L的GA3溶液浸泡24h,以蒸餾水浸種作為對(duì)照,進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),方法同1.2.3.(1)。1.2.4曼不同充填的制備(1)萌發(fā)抑制物的提取與生物測(cè)定取新采收的曼陀羅種子,參照趙敏的方法,用蒸餾水分別提取其種皮、種仁的抑制物,以蒸餾水作為對(duì)照,用白菜種子進(jìn)行生物測(cè)定,48h時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、測(cè)量幼苗根長(zhǎng)、稱量幼苗鮮重。每皿100粒,3次重復(fù)。內(nèi)源物抑制率計(jì)算公式:抑制率=(1-處理/對(duì)照)×100%(2)內(nèi)源抑制物的原位作用參照周艷玲的方法,取5支試管編號(hào),1、2、3號(hào)試管分別放入50粒曼陀羅種仁,4、5號(hào)試管分別放入50粒曼陀羅種子的種皮,各加10mL蒸餾水浸泡24h。處理1:將1號(hào)試管中浸泡過(guò)的種仁取出,取1號(hào)試管中6mL種仁浸泡液進(jìn)行培養(yǎng);處理2:將2號(hào)試管中浸泡過(guò)的種仁取出,用6mL蒸餾水進(jìn)行培養(yǎng);處理3:從3號(hào)試管中取出6mL種仁浸泡液,用以培養(yǎng)未浸泡過(guò)的干種仁;處理4:將3號(hào)試管中浸泡過(guò)的種仁取出,取4號(hào)試管中6mL種皮浸泡液進(jìn)行培養(yǎng);處理5:從5號(hào)試管中取出6mL種皮浸泡液,用以培養(yǎng)未浸泡過(guò)的干種仁;處理6(對(duì)照):取未浸泡過(guò)的干種仁,加6mL蒸餾水進(jìn)行培養(yǎng)。處理后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),方法同1.2.3.(1)。1.2.5種子處理與發(fā)芽試驗(yàn)取已經(jīng)過(guò)了生理休眠期的曼陀羅種子(儲(chǔ)存6個(gè)月后),進(jìn)行如下處理:(1)物理法:A.機(jī)械摩擦:將種子加細(xì)沙磨至種子表面失去光澤。B.干濕交錯(cuò):將種子先用蒸餾水浸泡24h,再置于30℃烘箱中烘24h,如此反復(fù)進(jìn)行3次。以不做任何處理的種子作為對(duì)照,進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。(2)化學(xué)法:A.H2SO4腐蝕種皮:將種子用濃H2SO4分別浸泡5、10、20、30、40、60min。B.NaOH腐蝕種皮:將種子用5%、10%、20%、30%NaOH溶液分別浸泡30、60、90、120、150min。處理后徹底沖洗干凈,以不做任何處理的種子作為對(duì)照,進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。1.3處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel及SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1曼不同種子生活力種子生活力是種子發(fā)芽的潛在能力或胚具有的生命力,具有生活力的種子不一定都具有發(fā)芽力,如果種子生活力顯著大于種子發(fā)芽率,說(shuō)明種子處于休眠狀態(tài)。表1顯示,供試的4組種子僅4粒為不正?；蛩劳龇N子,經(jīng)計(jì)算曼陀羅種子生活力百分比為98%。由表2可以看出,曼陀羅種子發(fā)芽勢(shì)為0,發(fā)芽率為6%,種子生活力遠(yuǎn)大于發(fā)芽率,說(shuō)明新采收的曼陀羅種子存在顯著的休眠現(xiàn)象。2.2曼陀羅種子發(fā)芽的繁殖障礙2.2.1發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率由圖1可以看出,新采收的曼陀羅種子經(jīng)機(jī)械摩擦和剝除種皮后均可極顯著提高種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率(P<0.01);機(jī)械摩擦和剝除種皮后,種子的發(fā)芽率分別為32.5%和58.5%,而對(duì)照的發(fā)芽率只有6%,說(shuō)明種皮障礙是曼陀羅種子休眠的重要原因。2.2.2種子的吸水性由圖2可以看出,未經(jīng)處理的曼陀羅種子在1h內(nèi)吸水最快,之后吸水速率逐步降低,24h時(shí)吸水速率趨于平穩(wěn);經(jīng)10%NaOH溶液處理90min后的種子在1h內(nèi)吸水最快,之后吸水速率也趨于平穩(wěn)。1h時(shí),對(duì)照種子吸水率只有31.3%,而經(jīng)10%NaOH溶液處理的種子吸水率達(dá)69.45%,說(shuō)明曼陀羅種皮透水性差,用NaOH腐蝕種皮,可以提高種子的吸水率,從而促進(jìn)種子萌發(fā)。2.2.3曼不同皮的透氣性由圖3可以看出,曼陀羅種子用0.25%H2O2浸種后,種子的發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照顯著提高(P<0.05)、發(fā)芽率比對(duì)照極顯著提高(P<0.01),說(shuō)明曼陀羅種皮透氣性比較差。因?yàn)橛肏2O2處理種子,可使種皮受到輕度腐蝕,增強(qiáng)種皮的透氣性。2.3曼陀羅工廠的休息機(jī)制2.3.1曼不同儲(chǔ)藏時(shí)期發(fā)芽率的變化由圖4可以看出,新采收的剝除了種皮的曼陀羅種子發(fā)芽勢(shì)為7.5%、發(fā)芽率為42.0%,其儲(chǔ)藏4個(gè)月和6個(gè)月時(shí),發(fā)芽率分別達(dá)到73.5%和87%。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道種子自然發(fā)芽率在80%以下的時(shí)期為種子休眠期,故推測(cè)出曼陀羅種仁休眠期為6個(gè)月;儲(chǔ)藏8個(gè)月時(shí)發(fā)芽率達(dá)到93.0%,接近其種子生活力,種仁休眠解除。可見(jiàn),曼陀羅種仁自然休眠期為6~8個(gè)月,隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng),即曼陀羅種子休眠原因主要是種皮障礙。2.3.2外源ga3對(duì)曼不同種子發(fā)芽率的影響由圖5可以看出,采收1周的曼陀羅種子(剝除種皮)用50mg/L到300mg/L的GA3溶液處理,發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均比對(duì)照極顯著提高(P<0.01)。GA3濃度為200mg/L時(shí),曼陀羅種子的發(fā)芽率達(dá)91.5%,可見(jiàn)用外源GA3浸種,可打破曼陀羅種子生理休眠,提高種子發(fā)芽率。同時(shí)也說(shuō)明曼陀羅新種子中缺少種子萌發(fā)的相關(guān)激素GA3。2.4曼陀羅種子發(fā)芽抑制2.4.1子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)、鮮重的抑制作用由表3可以看出,曼陀羅種皮、種仁水提液對(duì)白菜種子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)及鮮重均有抑制作用,且隨著濃度的提高抑制作用增強(qiáng),種仁的抑制活性大于種皮。由此可知,曼陀羅種皮、種仁中均存在水溶性萌發(fā)抑制物。2.4.2#ck比由圖6可以看出,曼陀羅種子不同處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)的大小順序均分別為:3<CK<1<2、5<CK<4<2、3<5(1)<(4)CK<4。以上結(jié)果說(shuō)明,曼陀羅種仁和種皮中均含有內(nèi)源萌發(fā)抑制物,而且曼陀羅種仁中萌發(fā)抑制物的活性大于種皮。2.5物理和化學(xué)法的睡眠效果2.5.1干旱交錯(cuò)處理發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率變化由表4可以看出,曼陀羅種子用機(jī)械摩擦處理后,發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均比對(duì)照極顯著提高(P<0.01),發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照提高33.5%,發(fā)芽率比對(duì)照提高48%。干濕交錯(cuò)處理后,發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照差異不顯著,發(fā)芽率與對(duì)照差異極顯著(P<0.01),發(fā)芽率比對(duì)照提高5%。因?yàn)榉N皮障礙是曼陀羅種子萌發(fā)的主要限制因素,所以用機(jī)械摩擦處理可以打破曼陀羅種子休眠。2.5.2發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的變化由圖7可以看出,曼陀羅種子用濃H2SO4處理不同時(shí)間后的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率先升高后降低。處理30min時(shí)的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率最高,均與對(duì)照差異極顯著(P<0.01),發(fā)芽勢(shì)達(dá)15%,比對(duì)照提高11%;發(fā)芽率達(dá)23%,比對(duì)照提高15%?？梢?jiàn)用濃H2SO4處理30min在一定程度上可以使曼陀羅種皮障礙解除而打破其種子休眠。2.5.3naoh處理3討論3.1曼陀羅種仁休醉期的確定本研究結(jié)果表明,去除種皮的曼陀羅新采收的種子自然休眠期為6~8個(gè)月,這個(gè)時(shí)間段休眠有其重要的生物學(xué)意義。曼陀羅為一年生植物,每年4~5月開(kāi)始出苗,9~10月果實(shí)成熟,從其果實(shí)成熟到來(lái)年發(fā)芽正好6~8個(gè)月時(shí)間,這個(gè)時(shí)間段長(zhǎng)度與我們測(cè)試得出的曼陀羅種仁休眠期剛好吻合,這有利于曼陀羅度過(guò)冬季不適宜生長(zhǎng)季節(jié),更好地保證來(lái)年種子在適宜生長(zhǎng)條件下萌發(fā),成功繁衍后代。由于曼陀羅種子成熟期不一致,導(dǎo)致所測(cè)新種子種仁休眠期表現(xiàn)為6~8月,而不是整齊一致時(shí)間。3.2抑制劑作用機(jī)理種皮障礙是限制曼陀羅種子萌發(fā)的首要因素。透性機(jī)理認(rèn)為種子的休眠程度與種皮的不透性或硬種皮有關(guān)。曼陀羅種皮堅(jiān)硬,且種皮表面角質(zhì)、蠟質(zhì)化。本研究發(fā)現(xiàn),曼陀羅種皮的透水性、透氣性差,堅(jiān)硬的種皮對(duì)胚發(fā)芽具有極大的機(jī)械限制。種皮對(duì)保護(hù)種子免受傷害有積極作用,但如果自然條件下過(guò)度干旱等因素使種皮障礙無(wú)法解除將會(huì)導(dǎo)致種子不能正常發(fā)芽出苗。種子休眠的抑制劑作用機(jī)理認(rèn)為,種子休眠是由于在種子的不同部位存在抑制物,如醛類、酚類、有機(jī)酸、脫落酸、生物堿等。本研究發(fā)現(xiàn),曼陀羅種子的種皮和種仁中也存在萌發(fā)抑制物,其中,生物堿是曼陀羅主要的藥用活性成分,但其是否就是抑制物的成分還有待進(jìn)一步研究確定。抑制劑作用機(jī)理的激素調(diào)控學(xué)說(shuō)認(rèn)為,導(dǎo)致種子休眠不僅是由于抑制物質(zhì)的存在,也可能是由于缺乏赤霉素和細(xì)胞分裂素,其中赤霉素為主要的調(diào)節(jié)因子。本研究表明,曼陀羅種皮、種仁中均有萌發(fā)抑制物,而且用外源GA3浸種可打破曼陀羅種子生理休眠,提高種子發(fā)芽率。眾所周知,ABA抑制種子萌發(fā),GA促進(jìn)種子萌發(fā),兩者的比例在種子休眠與萌發(fā)中起著重要的作用。那么是否曼陀羅種子內(nèi)源ABA過(guò)多或GA不足是導(dǎo)致其種子生理休眠的一個(gè)重要原因,有待進(jìn)一步研究。曼陀羅種子生理休眠期為6~8個(gè)月,屬中度休眠,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),種子中各種激素比例及抑制物種類、含量可能發(fā)生了變化,具體發(fā)生了哪些變化有待進(jìn)一步測(cè)定研究。光敏素轉(zhuǎn)化機(jī)理方面,Benvenuti研究表明,曼陀羅種子休眠不依賴于光敏素的轉(zhuǎn)化,但種子入土深度及光照強(qiáng)度對(duì)曼陀羅種子發(fā)芽的影響有待進(jìn)一步研究。3.3不同的處理對(duì)曼不同種子萌發(fā)的影響對(duì)于新采收的曼陀羅種子需要促進(jìn)其萌發(fā)時(shí),因其屬于綜合休眠,需用綜合法來(lái)打破種子休眠。建議先用機(jī)械摩擦或酸、堿處理以破除種皮障礙,再用GA3浸種。對(duì)于采收后6~8個(gè)月的曼陀羅種子,只需要破除種皮障礙即可打破種子休眠。本研究表明用機(jī)械摩擦、濃H2SO4處理和NaOH處理均可打破曼陀羅種子種皮障礙,促進(jìn)種子萌發(fā),NaOH處理效果最好。文獻(xiàn)報(bào)道破除硬實(shí)種子休眠最常用的方法為機(jī)械摩擦和濃H2SO4處理。用NaOH處理打破種子休眠的研究報(bào)道較少,如何學(xué)青等研究表明,羊草種子用30%NaOH處理60min,發(fā)芽率達(dá)到84%,而對(duì)照的發(fā)芽率只有6%。王繼朋和王微等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草種子用NaOH處理,可溶解種子穎苞表面的蠟質(zhì),增加種皮的透氣性和吸水率,提高種子的發(fā)芽率。關(guān)于曼陀羅種子用NaOH處理效果比濃H2SO4處理效果更好的原因我們推測(cè)是否因?yàn)槁恿_種子中有偏酸性的萌發(fā)抑制物被堿性的NaOH中和的緣故,這還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證方可得知。1)機(jī)械處理對(duì)曼陀羅種子進(jìn)行剝除種皮和細(xì)沙摩擦處理后,進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),以不做任何處理的種子作為對(duì)照。1)種仁休眠期測(cè)定曼陀羅種子采收晾干1周后剝?nèi)シN皮(去除了種皮障礙影響),開(kāi)始發(fā)芽試驗(yàn),每隔2個(gè)月測(cè)定1次室溫(溫度自然變化)貯藏下種子的發(fā)芽率。其發(fā)芽床為濾紙,25℃黑暗培養(yǎng),第5天時(shí)計(jì)算發(fā)芽勢(shì),第10天時(shí)計(jì)算發(fā)芽率。由圖8和圖9可以看出,NaOH濃度和處理時(shí)間對(duì)曼陀羅種子萌發(fā)