炎毒熱清及其微乳制劑的安全性和抑菌活性研究

炎毒熱清及其微乳制劑的安全性和抑菌活性研究

阿司匹林作為一種非體抗炎藥物已經(jīng)使用了100多年。然而，主要缺點(diǎn)是ph攝入強(qiáng)烈。長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致胃腸道粘膜損傷、胃腸道穿刺、肝臟和腎臟毒性等。將阿司匹林制成前體藥物,在體內(nèi)通過(guò)水解酶的作用還原成原藥無(wú)疑能增加其治療指數(shù),使之更好地發(fā)揮藥效。丁香酚是桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb)的干燥花蕾所含揮發(fā)油中的主要成分,具有廣泛的藥理活性,如抑菌、麻醉、解熱、抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收、祛蚊等,但揮發(fā)性和刺激性影響了其應(yīng)用。炎毒熱清(AEE)是由阿司匹林和丁香酚結(jié)合生成的一種新化合物,既降低了阿司匹林引起的消化道刺激,又解決了丁香酚的揮發(fā)性和刺激性問(wèn)題,進(jìn)入體內(nèi)后,水解為原藥協(xié)同發(fā)揮作用。微乳(microemulsion,ME)作為一種新劑型,近年來(lái)逐漸引起人們的重視。研究證明,微乳制劑可提高許多藥物在體內(nèi)的生物利用度;可同時(shí)包容不同脂溶性藥物,提高不穩(wěn)定藥物穩(wěn)定性;由于微乳粒徑小且均勻,還可提高包封于其中藥物的分散度,并促進(jìn)藥物的透皮吸收;其制備過(guò)程不需要特殊設(shè)備,作為藥物載體具有緩釋和靶向作用。將AEE制成微乳AEE-ME后,一方面通過(guò)增加藥物的脂溶性可增加微乳中的載藥量,另一方面可避免藥物在胃腸內(nèi)的首過(guò)效應(yīng)。該試驗(yàn)對(duì)AEE及AEE-ME的急性毒性和抑菌效果進(jìn)行研究,以期為其在臨床上的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。1材料和方法1.1男性無(wú)孕產(chǎn)無(wú)孕清潔級(jí)昆明系健康小白鼠,體重(20±2)g,雌雄各半,雌性未產(chǎn)無(wú)孕。由蘭州生物制藥廠提供,合格證號(hào)為SCXK(甘)2008-0075。在溫度18～25℃,濕度50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。1.2藥物、試劑和培養(yǎng)基AEE(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)和AEE-ME均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備,阿司匹林(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)、丁香酚(江西匯通藥用香料油有限公司)、二甲基亞砜(DMSO)(西安化學(xué)試劑廠)、CMC-Na(天津化學(xué)試劑廠)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)。1.3實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、恒溫培養(yǎng)箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、SNCJ1BU無(wú)菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)、培養(yǎng)皿、牛津管(直徑8.8mm)。1.4藥物、動(dòng)物及微生物豬大腸桿菌O149(EscherichiacoliO149fromswine)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。1.5培養(yǎng)基制備1.5.1添加糖液、葡萄糖液、供熱取蛋白胨3.0g、牛肉膏1.5g、NaCl0.9g、葡萄糖6.0g,加熱至完全溶解,調(diào)節(jié)pH為7.8～8.0,121℃、1.034×105Pa壓力下滅菌30min,放置備用。1.5.2冷卻、滅菌、冷卻按照說(shuō)明要求,稱取一定量營(yíng)養(yǎng)瓊脂,加入蒸餾水,加熱攪拌使其完全溶解,121℃高壓滅菌20min,冷卻至適宜溫度,倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。1.6菌種的準(zhǔn)備將上述供試菌種用適宜斜面培養(yǎng)活化后,用接種環(huán)從斜面上挑取少許,接入液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)16～18h,取一定量的菌液稀釋1000倍,供試驗(yàn)用。1.7aee和eae-me大鼠急性毒性試驗(yàn)1.7.1各組患者的cmc-na溶劑對(duì)照及比對(duì)AEE灌胃之前用0.5%CMC-Na制成懸浮液,在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)6個(gè)劑量組,每組劑量為20.00、15.00、11.25、8.44、6.33、4.75g/kg,第7組及第8組分別為CMC-Na溶劑對(duì)照和生理鹽水對(duì)照,組間比為0.75。AEE-ME在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)8個(gè)劑量組,每組劑量為15.00、11.25、8.44、6.33、4.75、3.60、2.70、2.00g/kg,同時(shí)每種劑量均設(shè)等劑量微乳空白對(duì)照,組間比為0.75。1.7.2小鼠分組及試驗(yàn)取健康小鼠,隨機(jī)分組,10只/組。AEE、ME、AEE-ME各80只。試驗(yàn)前小鼠禁食12h,自由飲水。試驗(yàn)時(shí)AEE組小鼠在2h內(nèi)灌胃給藥2次,ME組和AEE-ME組灌胃給藥1次,各組給藥容量均為0.03ml/g體重。1.7.3急性毒性反應(yīng)記錄植物神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)(畏光、皮毛豎起等)、呼吸、自發(fā)運(yùn)動(dòng)、肌肉運(yùn)動(dòng)及張力、對(duì)外界刺激反應(yīng)、死亡等毒性反應(yīng)癥狀,對(duì)尸體進(jìn)行剖解,觀察期為7d。1.7.4slgld50的計(jì)算用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)及其95%可信區(qū)間。公式:LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)](1)slgLD50=dΣpqn????√(2)slgLD50=dΣpqn(2)LD50的95%可信限=lg-1(lgLD50±1.96slgLD50)(3)式中,Xm為最大劑量對(duì)數(shù);d為相鄰劑量比值的對(duì)數(shù);p為各組的死亡率,用小數(shù)表示;∑p為各組動(dòng)物死亡率的總和;s為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差;q為各組動(dòng)物存活率;n為各組動(dòng)物數(shù)。1.8抗a和抗a-me試驗(yàn)1.8.1dmso空白倍比法①將備用AEE、阿司匹林、丁香酚用DMSO溶解,以無(wú)菌水進(jìn)行連續(xù)半倍稀釋法稀釋,其對(duì)應(yīng)量按藥量計(jì)算分別為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25mg/ml5種濃度,同時(shí)將DMSO也做相應(yīng)的空白倍比稀釋。②AEE-ME按照微乳載藥量直接用滅菌蒸餾水稀釋為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25mg/ml5種濃度,同時(shí)微乳也做相應(yīng)的空白倍比稀釋。1.8.2抑菌圈測(cè)定采用杯碟法。分別取5種已稀釋好的供試菌,均勻涂布接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上,用無(wú)菌眼科鑷子將經(jīng)過(guò)高溫滅菌的鋼圈均勻放于其上,再在其中滴加各種濃度的溶液(每個(gè)濃度重復(fù)4次)。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h,測(cè)量并記錄抑菌圈大小(mm)。以不產(chǎn)生抑菌圈的前一稀釋藥物濃度為MIC值。2結(jié)果與分析2.1ae、me和aee-me的快速毒性試驗(yàn)灌胃給藥后,觀察7d,記錄小鼠服用AEE、ME及AEE-ME的毒性反應(yīng),結(jié)果見表1。2.1.1般資料及剖解結(jié)果小鼠死亡多見于服藥后1d內(nèi)。一般在用藥2h左右藥物毒性開始發(fā)揮作用,小鼠活動(dòng)減少,精神逐漸萎靡,發(fā)抖、喘氣、腹式呼吸、打嗝、走路搖晃,倒地后,一時(shí)無(wú)法站立,做游泳狀,最后,頭向一側(cè)歪斜,亂跳或沿著籠壁轉(zhuǎn)圈,抽搐死亡。0.5%CMC-Na和生理鹽水對(duì)照組食欲和飲水正常,無(wú)死亡。剖解發(fā)現(xiàn)心臟正常,肺有輕微出血,胃和十二指腸有未消化的藥物,偶可見胃臌氣,肝、脾、腎正常。7d后脫頸椎處死未死亡的小鼠,除肝臟的顏色比正常顏色略深外,其他臟器均正常。將表1中的數(shù)據(jù)代入公式求得AEE的LD50為10.937g/kg,95%可信區(qū)間為9.309～12.850g/kg,說(shuō)明AEE實(shí)際無(wú)毒。2.1.2剖解變化結(jié)果小鼠染毒之后1h左右為死亡高峰期,給藥后,或沿著籠壁疾走,或精神萎靡不振,顫抖,喘息,對(duì)外界刺激的反應(yīng)性降低,出現(xiàn)腹痛,最后向一側(cè)歪斜倒地不起,死亡。剖解發(fā)現(xiàn)胃黏膜、十二指腸黏膜脫落;肝臟質(zhì)地變脆;心、肺、脾、腎正常。7d脫頸椎處死存活的小鼠,心肝脾肺腎胃腸等臟器正常。根據(jù)公式求得空白微乳的LD50為5.647g/kg,95%可信區(qū)間為4.613～6.913g/kg。2.1.3aee-meld50小鼠灌胃后的中毒癥狀及死亡剖解結(jié)果同ME溶劑,用改良寇氏法計(jì)算可得AEE-MELD50為5.357g/kg,95%可信區(qū)間為4.388～6.566g/kg。從以上數(shù)據(jù)可以看出,AEE-ME的毒性主要是由溶劑載體引起,且該制劑為低毒物質(zhì)。2.2mic的測(cè)定從表2中可以看出,AEE和AEE-ME對(duì)供試細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑制作用。AEE對(duì)豬大腸桿菌O149、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、無(wú)乳鏈球菌的MIC分別為10.00、20.00、20.00、10.00mg/ml;AEE-ME對(duì)豬大腸桿菌O149、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、雞白痢沙門氏菌、無(wú)乳鏈球菌的MIC分別為5.00、10.00、20.00、5.00、5.00mg/ml?？梢?AEE-ME抑菌作用強(qiáng)于AEE。3aee的不含毒性試驗(yàn)(1)采用改良寇氏法計(jì)算了AEE、ME溶劑和AEE-ME經(jīng)昆明系小白鼠口服的半數(shù)致死量(LD50)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,許多因素都能影響LD50值,如動(dòng)物品系、分組、溶媒、試驗(yàn)環(huán)境條件等,所以LD50值只是一個(gè)范圍值。(2)藥物安全性評(píng)價(jià)過(guò)程中,當(dāng)藥物不溶于水時(shí),一般均制成懸浮液以測(cè)定其毒性,0.5%CMC-Na由于無(wú)毒副作用且能使藥物較均勻地分布于其內(nèi)而常用于藥物安全性評(píng)價(jià)。該試驗(yàn)用0.5%CMC-Na將AEE制成懸浮液,灌胃給藥測(cè)定其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為10.937g/kg。根據(jù)藥物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),AEE屬實(shí)際無(wú)毒性物質(zhì)。(3)該試驗(yàn)選擇刺激性小的載體將AEE制備成微乳制劑(AEE-ME),灌胃給藥測(cè)定其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為5.357g/kg,該制劑的毒性主要由溶劑載體引起,但總的來(lái)看,其屬于低毒性物質(zhì)。(4)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌