而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件

生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)ComprehensiveExperimentsofBiotechnology生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)1主要內(nèi)容Contents：一、課程簡(jiǎn)介核酸的分離與純化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、電泳技術(shù)AgaroseGelElrctrophoresisandSDS

三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)PolymeraseChainReaction四、DNA序列測(cè)定DNASequencing五、分子雜交技術(shù)MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary

七、外源基因的克隆與表達(dá)

HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)IsolationandPurificationofProtein主要內(nèi)容Contents：2DNA序列測(cè)定

DNAsequencingDNA序列測(cè)定

DNAsequencing3

WalterGilbertFrederickSanger1975DNAsequencingdeveloped:WalterGilbertandAllanMaxamofHarvardUniversityandFredSangerofCambridgeUniversitysimultaneouslycomeupwithtwotechniquesfordeterminingtheexactsequenceofbasesthatmakeupagene.GilbertandSangersharethe1980NobelPrize(alsowithPaulBerg).WalterGil4一、概述DNA序列測(cè)定技術(shù)，是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠分離長(zhǎng)度達(dá)到300～500個(gè)堿基，而差別僅1個(gè)堿基的單鏈寡聚核苷酸。技術(shù)由三部分組成1產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段,差別僅1個(gè)堿基。2在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。3測(cè)序膠的放射性自顯影技術(shù)。一、概述DNA序列測(cè)定技術(shù)，是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電5末端終止法

Sanger-Coulson(dideoxyorenzymatic)sequencing化學(xué)裂解法

Maxam-Gilbert(chemical)sequencing測(cè)序方法

末端終止法Sanger-Coulson(dideoxy6末端終止法原理利用E.colipolymeraseI以單鏈DNA為模板，以dNTP和[

-32p]-dATP為底物合成互補(bǔ)的DNA鏈。當(dāng)反應(yīng)遇到雙脫氧的核糖核苷酸底物（ddNTP）時(shí)，摻入到新生的DNA鏈中，但是該雙脫氧的核糖核苷酸的摻入阻止了DNA鏈進(jìn)一步的延伸反應(yīng)，形成了長(zhǎng)短不同的DNA片段。通過(guò)電泳和放射自顯影讀出DNA序列。末端終止法原理利用E.colipolymeraseI以單73’-5’phosphodiesterbondPPi(pyrophosphate)ordiphosphate

DNA合成的底物

deoxynucleoside5’-triphosphatesdNTP(dATP,dGTP,dCTP&TTP)dATP3’-5’phosphodiesterbondPPi(8PhosphodiesterbondsinDNAHHHHO-O-P-O-CH2OO-BASE5’3’1’?2’HHHHO-O-P-O-CH2OO-BASE5’3’1’?2’-O-P-O-CH2HHOHHHOOO-BASE5’3’1’?2’5’3’3’-5’Phosphodiesterbridgeor3’-5’phosphodiesterbondPhosphodiesterbondsinDNAHHH9DNApolymeraseIfragment(Klenow),TaqDNApolymerase,Sequenase(T7phageDNApolymerasemodified)SubstratedNTP,[-32p]-dNTP,or[-35s]-dATP

ddNTPDNAsequencingdCTPddCTPHHDNApolymeraseIfragment(Kle10DideoxySequencingofDNADideoxySequencingofDNA11

proceedingforDNAsynthesis:

HddATPproceedingforDNAsynthesi12ReactionRequirementsfor

DideoxySequencingofDNA1.DNAtemplate:Single-strandedDNAmolecule(template)tobesequenced2.Primer:Oligonucleotideprimercomplementarytoupstreamregionoftemplate3.DNAploymerase:4.Substrates:AllfourdNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)OneofdNTPislabeledwithradioactiveisotope.5.OneofthefourddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP,orddTTP)areneededineachreactionvolume.ReactionRequirementsfor

Dide13ReactionRequirementsfor

DideoxySequencingofDNAReactionRequirementsfor

Dide14DideoxySequencingofDNAThefourseparatesequencingractionsareloadedontoapolyacrylaimdegelandresolvedbyelectrophoresisTheprimeroroneofthefourdNTPsareradioactivelylabeledAnx-rayfilmisexposedtothegelproducinganautoradiogramTheautoradiogramis“read”fromthebottomup.DideoxySequencingofDNAThef15（一）測(cè)序反應(yīng)：1.對(duì)于每組測(cè)序反應(yīng)，標(biāo)記四個(gè)0.5mleppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTPMix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?.對(duì)于每組四個(gè)測(cè)序反應(yīng),在一個(gè)eppendorf管中混合以下試劑：（1）樣品反應(yīng)：質(zhì)粒模板DNA2.1pmol；5×測(cè)序緩沖液5ml；引物4.5pmol；無(wú)菌ddH2O至終體積16ml。（一）測(cè)序反應(yīng)：16（2）對(duì)照反應(yīng)：pGEM-3Zf(+)對(duì)照DNA(4mg)4.0

l；5×測(cè)序緩沖液5

l；pUC/M13正向引物(4.5pmol)3.6

l；無(wú)菌ddH2O至終體積16

l。3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0

l測(cè)序級(jí)TaqDNA聚合酶(5u/

l)。用吸液器吸動(dòng)幾次混勻。4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4

l加入每一個(gè)d/ddNTP混合物的管內(nèi)。5.在微量離心機(jī)中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。（2）對(duì)照反應(yīng)：pGEM-3Zf(+)對(duì)照DNA(4mg)176.把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀，以[注意]中循環(huán)模式為基準(zhǔn)，開始循環(huán)程序。每個(gè)引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。

7.熱循環(huán)程序完成后，在每個(gè)小管內(nèi)加入3μlDNA測(cè)序終止溶液，在微量離心機(jī)中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。[注意]1、測(cè)序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：模板種類/長(zhǎng)度模板量

200bp(PCR產(chǎn)物)16ng3000-5000bp（超螺旋質(zhì)粒DNA)4mg48000bp(λ,粘粒DNA)1mg6.把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀，以[注意]中循環(huán)模18由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號(hào)比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時(shí)其用量要比其它模板大一些。

2、計(jì)算與4.5pmol相當(dāng)?shù)囊锛{克數(shù)可用以下一般公式：4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數(shù)

計(jì)算與1pmol相當(dāng)?shù)囊镂⒖藬?shù)可用以下一般公式：dsDNA:1pmol=(6.6×10-4mg)×n,n為模板堿基對(duì)數(shù)

ssDNA:1pmol=(3.3×10-4mg)×n,

n為模板堿基數(shù)

3、為阻止TaqDNA聚合酶延伸非特異性退火引物熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95℃。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時(shí)間不包括變溫時(shí)間。如果你無(wú)法確定使用何種模式，建議從模式1開始。由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號(hào)比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使19模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%95℃2分鐘。然后：95℃30秒(變性),42℃30秒(退火),70℃1分鐘(延伸)。模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。95℃2分鐘,然后:95℃30秒(變性),70℃30秒(退火/延伸)。4.在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過(guò)夜。（二）、測(cè)序凝膠板的制備1、玻璃板的處理：測(cè)序的玻璃板一定要先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時(shí)背景偏高(棕色)。短玻璃板經(jīng)硅化油處理可防止凝膠撕裂。模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%20（1）短玻璃板的處理A.在1ml95%乙醇,0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(BindSilane),配成新鮮的粘合溶液。B.用浸透新配的硅烷的吸水棉擦拭清洗并自然干燥玻璃板,整個(gè)板面都必須擦拭。C.4-5分鐘后,用95%乙醇單向擦玻璃板,沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次,每次均須換用干凈紙,除去多余的粘合溶液。[注意]1.在95%乙醇單向擦玻璃板時(shí)過(guò)度用力會(huì)帶走過(guò)多的粘合硅烷,使凝膠不能很好地粘附。2.準(zhǔn)備長(zhǎng)玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。3、防止粘合溶液沾染在長(zhǎng)玻璃板上是很重要的,否則將導(dǎo)致凝膠撕裂。（1）短玻璃板的處理21(2)、長(zhǎng)玻璃板的處理A.用浸Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過(guò)的長(zhǎng)玻璃板。B.5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。[注意]

1.用過(guò)的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗?；蛘吣z用10%NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長(zhǎng)玻璃板的工具分開，如果出現(xiàn)交叉污染，以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。(2)、長(zhǎng)玻璃板的處理222、凝膠的制備：（1）玻璃板經(jīng)硅化油處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側(cè)，將另一塊玻璃板壓于其上。在長(zhǎng)玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。（2）根據(jù)所需要的凝膠濃度，按下表制備測(cè)序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結(jié)果。配制時(shí)，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過(guò)濾，然后加過(guò)硫酸銨和TEMED。溶解尿素時(shí)不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，加入過(guò)硫酸銨和TEMED。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的TEMED和過(guò)硫酸銨。2、凝膠的制備：23

凝膠終濃度34568121618

尿素(g)4242424242424242

Acr&Bis(ml)7.51012142030405010×TBE緩沖液(ml)1010101010101010

雙蒸水(ml)47.5454340.5352515510%過(guò)硫酸銨(ml)0.80.80.80.80.80.80.70.7

TEMED(

l)8780808080704740(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。[注意]1、使用夾子固定玻璃板時(shí)，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過(guò)程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。2、灌制凝膠的過(guò)程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則影響測(cè)序的結(jié)果。凝膠終濃度3424（三）電泳：1、預(yù)電泳（1）當(dāng)凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過(guò)來(lái)，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（2）立即將膠板固定在測(cè)序凝膠槽中，一般測(cè)序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個(gè)電泳槽中，去除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準(zhǔn)備預(yù)電泳。（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應(yīng)先將水浴加熱至55℃后進(jìn)行預(yù)電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過(guò)程中自身產(chǎn)生的（三）電泳：1、預(yù)電泳25熱進(jìn)行保溫，如上海求精有機(jī)玻璃儀器生產(chǎn)的測(cè)序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個(gè)凝膠板的溫度一致。

（5）按30V/cm的電壓預(yù)電泳20-30分鐘。預(yù)電泳的過(guò)程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時(shí)使凝膠板達(dá)到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響測(cè)序的結(jié)果。

[注意]（1）.用鯊魚齒梳制作加樣孔時(shí)，應(yīng)注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬(wàn)注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果。

（2）.應(yīng)時(shí)刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。熱進(jìn)行保溫，如上海求精有機(jī)玻璃儀器生產(chǎn)的測(cè)序電泳槽，這262、樣品的制備：

當(dāng)在預(yù)電泳時(shí)，即可進(jìn)行樣品的制備，將反應(yīng)完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長(zhǎng)時(shí)間不用，則應(yīng)重新處理?？墒褂?-6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小于0.4mm的膠可能導(dǎo)致信號(hào)太弱。加樣時(shí)不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍(lán)色樣品。

2、樣品的制備：27

3、上樣及電泳

關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時(shí)擴(kuò)散出來(lái)的尿素，然后立即用毛細(xì)管進(jìn)樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進(jìn)行電泳，5分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒壓狀態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)55cm長(zhǎng)，0.2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態(tài)下電泳2小時(shí)即可走到底部，同時(shí)在電泳過(guò)程中，電流可穩(wěn)定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長(zhǎng)的序列，可采用兩輪或多輪上樣。3、上樣及電泳28[注意]

1、上樣電泳時(shí)，一定要注意凝膠板的溫度是否達(dá)到55℃左右，如果還沒有達(dá)到，則應(yīng)等溫度達(dá)到后才能上樣電泳。

2、一般來(lái)說(shuō)電泳時(shí)，不宜使用太高的電壓，因?yàn)樘叩碾妷簳?huì)使凝膠的分辨率降低，并且使帶擴(kuò)散。電泳中可進(jìn)行恒功率電泳。

[注意]29第二節(jié)T7DNA聚合酶測(cè)序技術(shù)一、概述：T7DNA聚合酶最初具有5‘→3’聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3‘→5’外切酶活性。當(dāng)T7DNA聚合酶用適當(dāng)方法處理后，可使3‘→5’外切酶活力明顯下降。改造后的T7DNA聚合酶又稱T7測(cè)序酶。使用T7測(cè)序酶得到的測(cè)序數(shù)據(jù)具有在每個(gè)堿基位置都有相對(duì)均勻的配對(duì)參入。因此,放射自顯影所得到的結(jié)果較為清晰易辯.。

對(duì)于許多模板來(lái)說(shuō),使用含有dGTP的混合物即可得到理想的測(cè)序結(jié)果。然而,如果出現(xiàn)了帶壓縮的問題，則用含dITP的混合物來(lái)取代常規(guī)的dGTP。dITP的摻入，使在富含GC的模板中也能有效地消除帶壓縮現(xiàn)象。第二節(jié)T7DNA聚合酶測(cè)序技術(shù)一、概述：T7DNA聚30

T7測(cè)序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續(xù)性，正因如此，該酶在使用中不同于Klenow片段和反轉(zhuǎn)錄酶。它幾乎沒有錯(cuò)誤性的終止，然而對(duì)于有緊密二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域,錯(cuò)誤的終止反應(yīng)會(huì)給閱讀序列帶來(lái)困難。如果碰到這些情況，應(yīng)使用一些高溫DNA聚合酶，如Promega公司的測(cè)序級(jí)TaqDNA酶。利用高溫DNA聚合酶獨(dú)有的耐熱特性，測(cè)序反應(yīng)可在不利于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的高溫條件下進(jìn)行。T7測(cè)序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續(xù)性，正因如此，31T7DNA聚合酶測(cè)序的快速而簡(jiǎn)便的方法是從Klenow酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶測(cè)序的操作步驟修改而來(lái)的，它的最大優(yōu)點(diǎn)是具有很高的5‘-3’的DNA合成活性和極低的3‘-5’端外切酶的活性。在測(cè)序過(guò)程中，若以同位素標(biāo)記則比Klenow大片段或反轉(zhuǎn)錄酶AMV效果好，可使條帶非常的均一，并且它的放射性背景極低。

T7DNA聚合酶測(cè)序的快速而簡(jiǎn)便的方法是從Kleno32T7DNA聚合酶測(cè)序時(shí)，DNA的合成是分二步完成的。第一步為標(biāo)記反應(yīng)，第二步方為雙脫氧鏈末端終止的DNA合成過(guò)程。在第一步過(guò)程中，引物的延伸是在較低濃度的脫氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反應(yīng)過(guò)程中，已含有經(jīng)放射性標(biāo)記的dATP。第二步過(guò)程中，脫氧三磷酸核苷酸濃度提高，并且加入雙脫氧的三磷酸核苷酸，DNA在合成過(guò)程中，因加入的雙脫氧三磷酸核苷酸而隨機(jī)終止，形成長(zhǎng)短不一的DNA片段。

二、材料：待測(cè)的DNA模板，可用雙鏈或單鏈模板。

T7DNA聚合酶測(cè)序時(shí)，DNA的合成是分二步完成的。33三、設(shè)備

高壓電泳儀，測(cè)序用電泳槽，照相顯影用大號(hào)塑料盆，制膠設(shè)備，吹風(fēng)機(jī)，放射自顯影盒，X-光片。

四、試劑

1、5×T7DNA聚合酶緩沖液：200mmol/LTris·Cl,pH7.5,100mmol/LMgCl2,250mmol/LNaCl。

2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。

3、DTT：0.1mol/L。

4、5×常規(guī)標(biāo)記混合物：7.5mmol/LdGTP,7.5mmol/LdCTP,7.5mmol/LdTTP。

5、5×dITP標(biāo)記混合物：15mmol/LdITP,7.5mmol/LdCTP,7.5mmol/LdTTP。三、設(shè)備高壓電泳儀，測(cè)序用電泳槽，照相顯影用大號(hào)塑料盆，制346、dNTPA溶液（適用于dGTP):80mmol/LdGTP,

80mmol/LdATP,80mmol/LdCTP,80mmol/LdTTP,50mmol/LNaCl。

7、ddG終止混合物(適用于dGTP)：dNTPA溶液再加8mmol/LddGTP。

8、ddA終止混合物(適用于dGTP)：dNTPA溶液再加8mmol/LddATP。

9、ddT終止混合物(適用于dGTP)：dNTPA溶液再加8mmol/LddTTP。

10、ddC終止混合物(適用于dGTP)：dNTPA溶液再加8mmol/LddCTP。

6、dNTPA溶液（適用于dGTP):80mmol/L3511、dNTPB溶液（適用于dITP):160mmol/LdITP,

80mmol/LdATP,80mmol/LdCTP,80mmol/L

dTTP,50mmol/LNaCl。

12、ddG終止混合物(適用于dITP)：dNTPB溶液再加1.6mmol/LddGTP。

13、ddA終止混合物(適用于dITP)：dNTPB溶液再加1.6mmol/LddATP。

14、ddT終止混合物(適用于dITP)：dNTPB溶液再加1.6mmol/LddTTP。

15、ddC終止混合物(適用于dITP)：dNTPB溶液再加1.6mmol/LddCTP。11、dNTPB溶液（適用于dITP):160mmol/3616、T7DNA測(cè)序酶。

17、酶稀釋緩沖液：10mmol/LTris·HCl,pH7.5,5mmol/LDTT,0.5mg/mlBSA。

18、終止溶液：95%甲酰胺，20mmol/LEDTA,0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯蘭

。

19、[

-32P]dATP或[

-35S]-dATP,35S的優(yōu)點(diǎn)是可使條帶為窄而清晰，并且操作更為安全。放射強(qiáng)度為：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。20、TE緩沖液：21、凝膠制備過(guò)程中的全套試劑。22、X光顯影液：H2O：50℃800ml，米吐爾2.2g，無(wú)水Na2SO372g，對(duì)苯二酚8.8g，無(wú)水NaCO348g,KBr4g，

定容至1000ml備用。

16、T7DNA測(cè)序酶。3723、F-5堅(jiān)膜定影液：水600ml,Na2S2O3240g,Na2SO315g,冰醋酸13.4ml；硼酸7.5g，粉狀鉀礬15g，定容至1000ml備用。

23、F-5堅(jiān)膜定影液：水600ml,Na2S2O3238五、操作步驟：（一）、模板制備

1、M13單鏈模板制備：在轉(zhuǎn)化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG的培養(yǎng)基上鋪板之后,含有M13重組子的細(xì)胞將表現(xiàn)出無(wú)色的"噬菌斑"，事實(shí)上受感染的細(xì)胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現(xiàn)噬菌斑是因?yàn)楸桓腥镜募?xì)菌在生長(zhǎng)速度上比其周圍未感染的細(xì)菌慢的緣故,從無(wú)色噬菌斑上得到的感染細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)便能產(chǎn)生測(cè)序反應(yīng)所需的單鏈模板。

（1）過(guò)夜培養(yǎng)的宿主細(xì)胞(如JM101)用3mlTYP肉汁培養(yǎng)基以1:100稀釋。在37℃強(qiáng)烈震蕩1小時(shí)之后,細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)早期。此時(shí),將一個(gè)合適的含有重組M13的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉(zhuǎn)入該細(xì)胞培養(yǎng)液中。五、操作步驟：（一）、模板制備39（2）37℃強(qiáng)烈震蕩(300rpm)培養(yǎng)6小時(shí)。

（3）把細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入兩只1.5mleppendorf管,12000g離心15分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管再離心15分鐘。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀),再轉(zhuǎn)到新的eppendorf管。

（4）將0.25體積的含20％PEG(-8000)的3.75M醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體?；靹蚝笾帽?0分鐘,再以12000g離心15分鐘,傾去上清液,再以同樣方法離心一次,用吸液器尖頭將殘留的PEG充分吸干凈。此時(shí)應(yīng)能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。

（2）37℃強(qiáng)烈震蕩(300rpm)培養(yǎng)6小時(shí)。40（5）將沉淀物重溶于400mlTE緩沖液中。

（6）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液,強(qiáng)烈震蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。

（7）將水相轉(zhuǎn)入一新的eppendorf管,注意不能觸動(dòng)原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿(1:1)混合液,強(qiáng)烈振蕩1分鐘,12000g離心5分鐘。

（8）將上層水相轉(zhuǎn)入另一新的eppendorf管,重復(fù)第7步的提取,如有必要重復(fù)多次直至二相之間無(wú)可見物質(zhì)存在。

（9）將上層水相轉(zhuǎn)入一新的eppendorf管,加等體積氯仿,強(qiáng)烈振蕩1分鐘后,12000g離心5分鐘,多次重復(fù)此步驟。

（10）將上層水相轉(zhuǎn)入新的eppendorf管,加0.5倍體積的7.5mol/L醋酸銨,2倍體積乙醇,混勻后-20℃放置30分鐘。

（5）將沉淀物重溶于400mlTE緩沖液中。41（11）12000g離心15分鐘,去除上清液,用70％乙醇小心清洗沉淀,如果沉淀已被攪起,重新離心,傾去酒精,真空干燥沉淀物。

（12）將DNA的沉淀物溶解于20ml去離子水中，取2ml樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量,如果DNA量充足,則可進(jìn)行退火測(cè)序。2、噬粒(Phagemid)單鏈模板的制備：

噬粒是指含有絲狀單鏈DNA噬菌體復(fù)制區(qū)的嵌合質(zhì)粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的質(zhì)粒均屬噬粒。含重組噬粒的細(xì)胞單菌落經(jīng)液體培養(yǎng)并用輔助噬菌體超感染后就能產(chǎn)生測(cè)序反應(yīng)所需的單鏈DNA模板。（11）12000g離心15分鐘,去除上清液,用70％乙42（1）從新鮮平板上挑得含pGEM質(zhì)粒DNA的抗Amp單菌落,并接種到100ml含有50mg/ml氨芐的TYP肉湯培養(yǎng)基中,在37℃振蕩過(guò)夜。

（2）取100ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種到另一新的裝有5ml含50mg/mlAmp的TYP肉汁培養(yǎng)基的試管中,在37℃強(qiáng)烈振蕩30分鐘。

（3）加40μl輔助噬菌體R408或M13K07,繼續(xù)劇烈攪拌振蕩培養(yǎng)6-8小時(shí)，使輔助噬菌體超感染。

（4）12000g離心15分鐘后，去除沉淀，取上清，轉(zhuǎn)移到一新eppendorf管中再次離心15分鐘,小心地取1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀)。

（1）從新鮮平板上挑得含pGEM質(zhì)粒DNA的抗Amp單菌落,43（5）將0.25體積的含20％PEG-的3.75M醋酸銨加入上清液以沉淀噬菌體顆粒?；靹蚝笾帽?0分鐘,再以12000g離心15分鐘,傾去上清液,再以同樣方法離心一次,用移液器尖頭將殘留的PEG溶液吸凈。此時(shí)應(yīng)能看到管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。

（6）將沉淀物溶解于400mlTE緩沖液(10mmol/LTris-HClpH8.0，1mmol/LEDTA)。

（7）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液,強(qiáng)烈振蕩1分鐘,再以12000g離心5分鐘。

（8）將水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管,加等體積酚/氯仿(1:1)混合液,強(qiáng)烈振蕩1分鐘,12000g離心5分鐘。

（9）上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管重復(fù)第8步驟,如有必要重復(fù)多次直至二相之間無(wú)可見物質(zhì)。

（5）將0.25體積的含20％PEG-的3.75M醋酸銨加44（10）將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管加等體積氯仿,強(qiáng)烈振蕩1分鐘后離心,多次重復(fù)此步驟。

（11）將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管加0.5倍體積7.5mol/LpH7.5醋酸銨,再加2倍體積乙醇,混和后-20℃放置30分鐘。

（12）12000g離心15分鐘,去除上清液,用70％乙醇小心清洗沉淀,如沉淀已被攪起,重新離心,傾去乙醇,真空干燥沉淀。

（13）將沉淀物溶解于20ml去離子水中,取2ml樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定量，如果DNA量充足，則進(jìn)行退火和測(cè)序。

3、質(zhì)粒膜板制備：參照以前所述的方法。（10）將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管加等體積氯仿45（二）超螺旋質(zhì)粒DNA的堿變性1、取4mg（約2pmol）超螺旋質(zhì)粒DNA至一eppendorf管中，加無(wú)離子水到終體積18ml。

2、加2ml2mmol/LNaOH/2mmol/LEDTA溶液,置于室溫(25℃下）保溫5分鐘。

3、加2ml2mol/LNaAc溶液(pH4.6)渦旋混勻，使之中和。

4、加75ml無(wú)水乙醇，充分混勻后，置于干冰或-70℃沉淀10分鐘。

5、于12000g離心10分鐘，棄去上清，用200ml預(yù)冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml無(wú)離子水中。（二）超螺旋質(zhì)粒DNA的堿變性1、取4mg（約2pmol）超46（三）、測(cè)序反應(yīng)：1、引物和模板的退火：

（1）在一離心管中，混合如下幾種試劑：

引物

約1-2pmol

5×T7DNA聚合酶測(cè)序反應(yīng)緩沖液2ml

DNA約1mg加ddH2O終體積至10ml。

（2）將試管蓋蓋上后，65℃加熱2分鐘，然后在大約30分鐘左右的時(shí)間內(nèi)，使試管的溫度緩慢地降到室溫。降溫的過(guò)程中可使用小的加熱板或小型的保溫儀，也可使用已調(diào)至65℃的水浴，使它們的溫度在室溫下緩慢地降至室溫即可。當(dāng)溫度降至30℃以下時(shí)，退火結(jié)束?？蓪⑿≡嚬苤糜诒希嘶鹜戤叺哪０屙氃?小時(shí)內(nèi)使用。（三）、測(cè)序反應(yīng)：1、引物和模板的退火：47

2、標(biāo)記反應(yīng)

（1）在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)過(guò)程中（從引物處開始，可讀到500個(gè)堿基以上），首先需要按1:5稀釋標(biāo)記混合物。如4ml混合物則加雙蒸無(wú)離子水16ml。該稀釋液儲(chǔ)存在-20℃可使用數(shù)周。如果所要測(cè)定的序列小于30個(gè)堿基，可將標(biāo)記緩沖液稀釋15倍，同時(shí)，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，會(huì)降低標(biāo)記反應(yīng)的程度，即只標(biāo)記引物后的幾個(gè)核苷酸。

（2）用冰預(yù)冷的TE緩沖液按1:8稀釋T7DNA聚合酶。酶液稀釋后應(yīng)立即使用，置于冰浴不宜超過(guò)60分鐘。不得使用標(biāo)記混合物、DTT溶液或非緩沖液類溶液稀釋酶液。

（3）在已退火的引物-模板混合物中，依次加入2、標(biāo)記反應(yīng)480.1mol/LDTT1.0ml

標(biāo)記混合物2.0ml

[

-32P]dATP或[

-35S]dATP0.5ml已稀釋好的T7DNA聚合酶2.0ml混合充分（注意不得產(chǎn)生氣泡），置于室溫5-10分鐘。

如果在電泳時(shí)碰到帶壓縮問題，則dITP混合物的效果優(yōu)于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法與dGTP混合物的使用是相似的。0.1mol/LDTT1.0m49[注意]1、稀釋時(shí)應(yīng)將所有的溶液預(yù)先混合完全后再加入酶液。

2、在第（3）步的過(guò)程中，如果反應(yīng)中有幾次冷卻，保溫的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度太高的話，則會(huì)使測(cè)序反應(yīng)短于100個(gè)堿基。

3、鏈終止反應(yīng)：

（1）取4支eppendorf管分別標(biāo)上G，A，T，C。

（2）每個(gè)管分別加入2.5mlG，A，T，C鏈末端終止混合物，立即蓋上蓋子以防液體蒸發(fā)（本反應(yīng)最好在標(biāo)記反應(yīng)前做好）。dGTP和dITP混合物依據(jù)各自需要選用。

（3）將eppendorf管預(yù)熱至37℃1分鐘。[注意]1、稀釋時(shí)應(yīng)將所有的溶液預(yù)先混合完全后再加入酶液。50（4）待標(biāo)記反應(yīng)完畢后，取3.5ml標(biāo)記反應(yīng)液至上述4支eppendorf管中，稍微離心一下，并將上述四管置于37℃保溫。注意在每一次反應(yīng)中，均應(yīng)使用新的吸液頭，以免交叉污染。

（5）繼續(xù)保溫3-5分鐘（若使用dITP時(shí)，保溫時(shí)間可延長(zhǎng)至30分鐘，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物沒有任何影響。

（6）在上述四管中各加入4ml終止緩沖液?；旌暇鶆蚝螅糜诒≈?。本樣品即可上樣電泳。用35S標(biāo)記反應(yīng)的樣品可置于-20℃保存一周，此時(shí)樣品只有極少量的降解。而32P標(biāo)記的則需在當(dāng)天電泳以免降解。（4）待標(biāo)記反應(yīng)完畢后，取3.5ml標(biāo)記反應(yīng)液至上述4支ep51（四）測(cè)序凝膠板的制備及電泳

參考第一節(jié)測(cè)序凝膠板的制備及電泳部分。樣品加熱至75-80℃2分鐘，立即上樣，每個(gè)泳道的使用量為2-3

l。（五）測(cè)序凝膠板的干燥及放射自顯影。

電泳完畢后，經(jīng)32P或35S標(biāo)記的產(chǎn)物可用對(duì)

-射線敏感的X-光膠片放射自顯影檢測(cè)。

1、取下電泳的玻璃板，去除兩邊的壓條，用小的薄鋼片撬開玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷處理過(guò)，凝膠會(huì)緊緊地粘合于玻璃板上，則凝膠與玻璃板一起進(jìn)行下面步驟的處理。如果玻璃板沒有經(jīng)過(guò)粘合硅烷的處理，則可用3MM大濾紙貼在有凝膠的玻璃板上，小心地揭下凝膠，準(zhǔn)備下一步的處理。

（四）測(cè)序凝膠板的制備及電泳參考第一節(jié)測(cè)序凝膠板的制備及電522、去除尿素，將含有凝膠的玻璃板或?yàn)V紙浸于含有2升10%冰醋酸的大號(hào)顯液盆中，輕輕振蕩15分鐘，去除尿素。

3、干膠：含有凝膠的玻璃板可用電吹風(fēng)吹干，而含有凝膠的濾紙則可用專用的干膠設(shè)備如真空加熱干膠儀抽干。

4、已經(jīng)干燥的凝膠即可進(jìn)行放射自顯影。在玻璃板含有凝膠的這一面加上X-光片后，用另一塊相似大小的玻璃板夾住，然后用夾子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝膠的濾紙則可置于X-光曝光盒中放射自顯影。一般32P曝光過(guò)夜即可，而35S為2-3天。

2、去除尿素，將含有凝膠的玻璃板或?yàn)V紙浸于含有2升10%冰醋535、曝光完畢后的X-光片即可沖洗，獲得序列信息。將X光片置于水中先濕潤(rùn)，然后置于顯影液中顯影，直至條帶清晰顯示為止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分鐘以上。取出X-光片干燥并讀出序列。[注意]1、去除尿素是非常重要的，如果有殘存的尿素，則在干膠過(guò)程中會(huì)使凝膠很粘，而無(wú)法進(jìn)行放射自顯影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分鐘，第二次10分鐘。如果膠濃度高于12%，則有可能在干膠過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生皺紋，防止的方法有二種：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；5、曝光完畢后的X-光片即可沖洗，獲得序列信息。將X光片置于54（2）不干燥膠，直接在冰箱中以冰凍狀態(tài)曝光，應(yīng)注意的是在使用這個(gè)方法時(shí)，要在凝膠和X-光片之間加一層薄的塑料薄膜。一般來(lái)說(shuō)都使用第一種方法。

2、凝膠一定要充分干燥方可進(jìn)行曝光，否則X-光片會(huì)粘在膠的表面，致使以后的操作困難。3、曝光時(shí)間應(yīng)根據(jù)所使用的同位素而定，如果同位素已過(guò)半衰期則應(yīng)相應(yīng)延長(zhǎng)曝光的時(shí)間。

思考題：1、測(cè)序結(jié)果的基本原理是什么？主要影響因素是什么？應(yīng)如何消除？

2、如何獲DNA測(cè)序膠板上的DNA序列的信息？（2）不干燥膠，直接在冰箱中以冰凍狀態(tài)曝光，應(yīng)注意的是在使用55而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件56而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件57Somethoughtsondesigningprimers.

1.

primersshouldbe17-28basesinlength;

2.

basecompositionshouldbe50-60%(G+C);

3.

primersshouldend(3')inaGorC,orCGorGC:thisincreasesefficiencyofpriming;

4.

Tmsbetween55-80oCarepreferred;

5.

3'-endsofprimersshouldnotbecomplementary(ie.basepair),asotherwiseprimerdimerswillbesynthesizedpreferentiallytoanyotherproduct;

6.

primerself-complementarity(abilitytoform2ostructuressuchashairpins)shouldbeavoided;

7.

runsofthreeormoreCsorGsatthe3'-endsofprimersmaypromotemisprimingatGorC-richsequences(becauseofstabilityofannealing),andshouldbeavoided.

preferentialSomethoughtsondesigningpri58DNAsequencing1.primerself-complementarity(abilitytoform2ostructuressuchashairpins)shouldbeavoided;

2.primersshouldnotbecomplementary,otherwiseprimerdimerswillbesynthesizedpreferentiallytoanyotherproduct;

DNAsequencing1.primerself-c59DNAsequencingdATPdATPdATPdATPdCTPdCTPdCTPdCTPdGTPdGTPdGTPdGTPdTTPdTTPdTTPdTTP++++ddATPddCTPddGTPddTTPACGTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTTCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGTTTTTGCTCTACTAGGTTAGTTTTTGCTCTACTAGGTTGTTTTTGCTCTACTAGGTGTTTTTGCTCTACTAGGGTTTTTGCTCTACTAGGTTTTTGCTCTACTAGTTTTTGCTCTACTGTTTTTGCTCTACGTTTTTGCTCTAGTTTTTGCTCTGTTTTTGCTCGTTTTTGCTGTTTTTGCGTTTTTGGTTTTTGTTTTGTTTGTTGTG5’GAAAGGACCGGCATAACCTAGTAGAGCAAAAAC3’3’CTTTCCTGGCCGTATTGGATCATCTCGTTTTTG5’DNAsequencingdATPdATP60二、DNA序列的自動(dòng)測(cè)定的基本原理和操作方法2.1基本原理由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)家Sanger等人1977年創(chuàng)建的利用DNA聚合酶和雙脫氧核苷酸末端終止法測(cè)序已成為現(xiàn)今自動(dòng)測(cè)序的最佳選擇方案。二、DNA序列的自動(dòng)測(cè)定的基本原理和操作方法2.1基本原理612.2其獨(dú)特性在于：帶4種不同熒光染料的雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)作為鏈終止劑，而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記。采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿基的單鏈DNA。一個(gè)樣品的4個(gè)測(cè)序可以在一個(gè)泳道內(nèi)電泳，從而降低了測(cè)序泳道間遷移率差異對(duì)精確性的影響。電泳之后，就可以通過(guò)全自動(dòng)激光激發(fā)以及熒光檢測(cè)而直接“讀出”堿基順序。

2.2其獨(dú)特性在于：622.3組成包括電泳系統(tǒng)、激光檢測(cè)裝置、電腦、彩色打印機(jī)、DNA序列分析軟件及DNA片段大小和定量分析軟件。該系統(tǒng)采用電腦單點(diǎn)控制整個(gè)DNA測(cè)序儀，包括電泳參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)收集、分析及結(jié)果輸出。電腦可在電泳過(guò)程中對(duì)儀器運(yùn)行狀態(tài)進(jìn)行同步檢測(cè)，電泳結(jié)果可以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。2.3組成63而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件64而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件65Whenthedesiredproductisobtained,itwillbesequencedby

theCentralServicesLabSequencingWhenthedesiredproductis66而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿課件67AppliedBiosystemsPRISM377(Gel,34-96lanes)AppliedBiosystemsPRISM3100(Capillary,16capillaries)AppliedBiosystemsPRISM3700(Capillary,96capillaries)AppliedBiosystemsPRISM377Ap68化學(xué)裂解法的原理首先對(duì)待測(cè)的DNA片段進(jìn)行單側(cè)末端標(biāo)記，將標(biāo)記后的DNA片段分成4-5個(gè)反應(yīng)體系，分別用不同的化學(xué)試劑處理，使DNA片段分別于某一種或某一類堿基處斷裂。使得平均每個(gè)DNA分子只在一個(gè)位置被裂解，而切斷裂的位置隨機(jī)發(fā)生在DNA片段某種堿基中的任何一個(gè)上?；瘜W(xué)裂解法的原理首先對(duì)待測(cè)的DNA片段進(jìn)行單側(cè)末端標(biāo)記，將標(biāo)69TheCy-5groupshowedreasonablestabilitytowardsmostchemicalreagentsusedintheMaxam-Gilbertprotocol.ThecleavageofCy-5-labeledDNAatG-sites(dimethylsulfate)oratA+Gsites(piperidineformate)wasespeciallyeffective;almostnofluorescencewaslostaftercleavage.ModificationofDNAwithhydrazine(cleavageatCorC+T)resultedinthelossofapproximatelyhalfofthefluorescenceduringthecourseofincubation;tocompensateforthis,gelswereloadedwith2timesmoreDNAthanusedfortheAorA+Greactions.ThemodificationofDNAwithNaOH(A>C)didnotworkinourhands;itseemsthatprolongedincubationunderalkalineconditionsdegradestheCy-5label;incubationoflabeledDNAwithNaOHforshorterperiodsoftimeisapparentlynotsufficienttomodifyDNA.TheCy-5groupshowedreasonab70MAXAM-GILBERTSEQUENCINGThischemicalcleavagemethodusesdouble-strandedDNAsamplesandsodoesnotrequirecloningofDNAintoanM13phagevectortoproducesingle-strandedDNAasisthecasewiththeSanger-Coulsonmethod.ItinvolvesmodificationofthebasesinDNAfollowedbychemicalbase-specificcleavage.Stages:Double-strandedDNAtobesequencedislabelledbyattachingaradioactivephosphorus(32P)grouptothe5'e