度人教版血紅蛋白的提取和分離

2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組時代。人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究

新華網(wǎng)首爾１２月２９日電（記者干玉蘭）韓國浦項工業(yè)大學(xué)科學(xué)家２９日宣布，他們已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)。浦項工業(yè)大學(xué)生物科學(xué)系教授吳秉夏等人，當(dāng)天公開了“ＴＲＩＭ５”蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三維分子結(jié)構(gòu)，并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用。研究成果發(fā)表在最新一期《分子細(xì)胞》雜志上。

2００４年英國《自然》雜志曾刊登論文說，“ＴＲＩＭ５”蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科學(xué)家開始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進(jìn)展。我國對蛋白質(zhì)的現(xiàn)階段研究

我國獨立主持國際“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”，參加國際人類蛋白質(zhì)組研究計劃中的“大規(guī)?？贵w制備”項目

專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題3：血紅蛋白的提取和分離思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？一.基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)分離和提取的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性（理化性質(zhì)）的差異,

來分離不同種類的蛋白質(zhì)。(如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等)（一）凝膠色譜法1、概念：

也稱分配色譜法，根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、凝膠的基本知識：凝膠形態(tài)：組成：

結(jié)構(gòu)：微小多孔的球體大多是由多糖類化合物形成如葡聚糖、瓊脂糖內(nèi)含許多貫穿的通道

①大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道；3、凝膠色譜法的原理③分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。②當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；4、分離過程混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

1、使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)實驗中,相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過程,可表示為圖中

（

）練習(xí)鞏固

（二）緩沖溶液

1.概念:

在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。

4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察和研究。磷酸緩沖液（三）電泳1、概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2、原理：◆電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離?！粼S多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。◆在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。++++++++++++++++++++電泳原理圖解原理(p66):SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。

為什么提取血紅蛋白用哺乳動物的紅細(xì)胞？哺乳動物的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，并且血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。

？

動動腦二、實驗操作－－實驗步驟樣品處理粗分離純化純度鑒定

血液組成成分

1.洗滌

紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白3.分離血紅蛋白4.透析血紅蛋白課題3血紅蛋白的提取和分離血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的______________________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素課題3血紅蛋白的提取和分離（Ⅱ）

1.洗滌

紅細(xì)胞洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂紅細(xì)胞破碎液高速離心10min離心管濾紙過濾燒杯3分離血紅蛋白4透析純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫課題3血紅蛋白的提取和分離材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱3.樣品的加入和洗脫課題3血紅蛋白的提取和分離（Ⅱ）注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：

沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)