濁度自動(dòng)化儀器分析

1．了解免疫檢測自動(dòng)化的基本概念2．了解免疫檢測自動(dòng)化設(shè)計(jì)的基本原理3．了解免疫檢測自動(dòng)化儀器在臨床上的應(yīng)用4．掌握常用的幾種免疫檢測自動(dòng)化儀器的檢測原理、應(yīng)用以及評價(jià)，本章重點(diǎn)第1頁/共42頁

免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化(automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和檢測后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)行。第2頁/共42頁第一節(jié)自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)第3頁/共42頁免疫濁度分析屬液相沉淀試驗(yàn)，其基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

第4頁/共42頁一、免疫透射比濁法【原理】一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱(圖9-7)，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。第5頁/共42頁第6頁/共42頁

二、免疫膠乳比濁法

原理

用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個(gè)膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強(qiáng)。

第7頁/共42頁三、免疫散射比濁法【原理】

粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：第8頁/共42頁

式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強(qiáng)度；λ和I0為入射光的波長和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4第9頁/共42頁顆粒直徑<1/10λRayleigh散射1/10λ<顆粒直徑≤λDebye散射顆粒直徑≥λMile散射第10頁/共42頁

㈠定時(shí)散射比濁法（fixedtimenephelometry）

定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動(dòng)較大，所獲取的信號計(jì)算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。

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㈡速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的速度（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各單位時(shí)間內(nèi)復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測僅1min～2min即可完成。

第12頁/共42頁表抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20第13頁/共42頁抗原抗體反應(yīng)速率的動(dòng)態(tài)變化第14頁/共42頁第15頁/共42頁第16頁/共42頁BNProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀第17頁/共42頁BNP防抗原過量的設(shè)計(jì)：優(yōu)化反應(yīng)條件，令初始稀釋度分析范圍更寬，保證抗原抗體反應(yīng)呈最佳比例預(yù)反應(yīng)程序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral計(jì)算程序第18頁/共42頁定時(shí)散射比濁法測定原理示意圖

第19頁/共42頁IMMAGE全自動(dòng)特定蛋白分析儀第20頁/共42頁第21頁/共42頁一、特異性二、比例性三、可逆性一、抗體來源：兔，羊，---二、親合力三、濃度四、電解質(zhì)，(增濁劑)五、pH

六、溫度抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的影響因素第22頁/共42頁抗體抗體的質(zhì)量

特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，R型抗體的含量

抗體過量第23頁/共42頁抗體的特異性

抗體只針對相應(yīng)的抗原，非特異性的交叉反應(yīng)會引起偽濁度。第24頁/共42頁抗體的效價(jià)

一個(gè)合格的比濁用抗體其效價(jià)必須在1：20（抗體稀釋度）以上，否則易形成偽濁度。第25頁/共42頁抗體的親和力

親和力強(qiáng)則抗體活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)速度，而且形成的免疫復(fù)合物較牢固，不易發(fā)生解離。第26頁/共42頁R型抗血清以家兔為代表的小動(dòng)物血清，如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等動(dòng)物的免疫血清。這類抗血清親和力高，與抗原結(jié)合后不易再解離，抗體過剩時(shí)易形成大而穩(wěn)定的復(fù)合物，抗原過剩時(shí)則形成可溶性復(fù)合物。第27頁/共42頁H型抗血清以馬為代表的大動(dòng)物血清，如驢、騾、馬等動(dòng)物的免疫血清。該血清親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易再解離，抗原過剩和抗體過剩皆易形成可溶性復(fù)合物。第28頁/共42頁pH：6.5~8.5離子強(qiáng)度：在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC形成快；離子強(qiáng)度過低或無電解質(zhì)存在，則不易出現(xiàn)可見的沉淀反應(yīng)。第29頁/共42頁3.增濁劑的使用

為了提高抗原抗體復(fù)合物的形成速度，常常要加入增濁劑，如分子量為6000～8000的3%～4%聚乙二醇（PEG）或吐溫-20（tween-20），以消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合。但PEG濃度過高，分子量過大會引起血清中其他蛋白質(zhì)（如IgM、α2巨球蛋白、脂蛋白）非特異性沉淀，形成偽濁度。因此，使用恰當(dāng)?shù)脑鰸釀?，合適的濃度是準(zhǔn)確測定所必須的。

第30頁/共42頁4.偽濁度非抗原抗體特異性結(jié)合形成的濁度，稱為偽濁度，可導(dǎo)致抗原檢測結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因包括①混濁標(biāo)本、高血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；②抗體效價(jià)低（<1:20）、抗血清滅活處理、抗血清含有交叉反應(yīng)性抗體等；③增濁劑PEG濃度過高；④抗血清細(xì)菌污染和變質(zhì)；⑤器材尤其是比色杯不清潔、塵埃污染等；⑥緩沖液的離子強(qiáng)度太高，pH和溫度不適合等，都對濁度產(chǎn)生影響。

第31頁/共42頁5.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制

應(yīng)用儀器規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品制備劑量-反應(yīng)曲線，一般采用5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法進(jìn)行曲線擬合；

每更換一批試劑，應(yīng)重新制備劑量-反應(yīng)曲線。為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，選取合適的質(zhì)控血清，每次開機(jī)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制是極其必要的。

第32頁/共42頁第33頁/共42頁根據(jù)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動(dòng)酶免分析儀分成二類，一類為分體機(jī)，一類為連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)酶免分析儀兩個(gè)獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個(gè)模塊組成，使用一臺計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動(dòng)進(jìn)行。

自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第34頁/共42頁全自動(dòng)酶免分析儀可對6～30塊板酶標(biāo)板同時(shí)進(jìn)行工作，具有一套完整的工作和分析系統(tǒng)，不同的儀器大小不同、配置不同，但性能基本相同。

第35頁/共42頁1.條形碼識別系統(tǒng)

2.樣本架和加樣系統(tǒng)

3.試劑架

4.溫育系統(tǒng)

5.液路系統(tǒng)

6.洗板系統(tǒng)

7.

酶標(biāo)板讀數(shù)儀

8.自動(dòng)裝載傳遞系統(tǒng)

9.計(jì)算機(jī)管理和信息系統(tǒng)

第36頁/共42頁第37頁/共42頁第38頁/共42頁第39頁/共42頁儀器評價(jià)全自動(dòng)酶免分析儀中的連體機(jī)是將樣本處理