生化實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量測定

生物化學(xué)實驗第一部分果蔬成分的生化分析綜合實驗一：果蔬成分的生化分析實驗一果蔬中維生素C的定量測定（4學(xué)時）實驗二果蔬中總糖及還原糖含量的測定（4學(xué)時）實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測定（4學(xué)時）實驗四果蔬中過氧化物酶分析（12學(xué)時）實驗材料：冬棗＋柚子——1～4組梨（2個品種）——5～8組盤菜＋蘿卜——9～12組實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍(lán)法）一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測定的方法和技術(shù)。

2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。二、原理考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。三、實驗器材1、可見光分光光度計2、旋渦混合器3、試管16支四、實驗試劑1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液——牛血清清蛋白(bsa)：配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。2、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。3、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）4、各種果蔬五、操作1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支試管，按下表加入各試劑。

管號試劑012345100

g

/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸餾水／mL1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)液／mL5.05.05.05.05.05.0

加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（

g）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品制備：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質(zhì)提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）3、樣品測定：試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL，再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A595。根據(jù)所測A595從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。注意事項：⑴、如果測定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成。⑵、測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，測定完后可用95%的乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測定（Folin-酚試劑法

）一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測定的方法和技術(shù)。

2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。二、原理

Folin-酚試劑法是雙縮脲法的發(fā)展。其試劑由甲、乙兩部分組成。甲試劑相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與肽鍵起呈色反應(yīng)。乙試劑（即Folin-酚試劑）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢蘭的混合物），其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此通過比色可測定蛋白質(zhì)的濃度。本方法最大的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏10～20倍。三、實驗器材1、分光光度計2、電熱恒溫水浴箱3、試管15×150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、試管架6、容量瓶500mL7、坐標(biāo)紙四、實驗試劑1、甲試劑：①：2g無水碳酸鈉，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100mL混勻；②：稱取CuSO4·5H2O0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。使用前將①與②按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和0.5%CuSO4·5H2O溶液可分別長期保存）2、乙試劑：在2L磨口回流裝置中加入100g鎢酸鈉，25g鉬酸鈉及700mL蒸餾水，再加入50mL85%磷酸及100mL濃HCl，充分混合后用小火回流10小時?；亓魍戤吚鋮s后，加入150g鋰，50mL蒸餾水及液體溴數(shù)滴，搖勻后再開口沸騰15分鐘，以驅(qū)逐過量溴。溶液冷卻后稀釋至1000mL，溶液呈透明淡黃色，置于棕色瓶中暗處冰箱內(nèi)可長期保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液標(biāo)定，以酚酞為指示劑，標(biāo)定其酸度為1mol/L，此為乙試劑應(yīng)用液，置冰箱中可長期保存。3、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200

g/mL）：準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250mL。4、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）5、各種果蔬五、操作1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支試管，按下表加入各試劑。試劑0123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸餾水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲試劑5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計，在波長500nm下，以“0”號管調(diào)零，測定各管吸光度。以各管吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品制備：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質(zhì)提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）3、樣品測定：取2只試管編號，按下表加入試劑：試劑空白管測定管蛋白質(zhì)提取液-1.0mL蒸餾水1.0mL-甲試劑5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計，在波長500nm下，以“0”號管調(diào)零，測定各管吸光度六、結(jié)果處理根據(jù)測定管吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克鮮果蔬中蛋白質(zhì)的微克數(shù)。注意事項：1、Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿性的銅離子-蛋白質(zhì)溶液中時（pH約10），必須立即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即發(fā)生還原反應(yīng)。2、本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾Folin-酚反應(yīng)。3、所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸也會干擾Folin