克氏原螯蝦爛尾病病原的分離鑒定

克氏原螯蝦爛尾病病原的分離鑒定

克氏原蝦腐敗是一種細(xì)菌疾病，也經(jīng)常發(fā)生在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中。主要原因是機(jī)械損傷、相互毆打和細(xì)菌感染，但菌株的類型沒(méi)有確定。在爛尾病發(fā)病早期，患病蝦出現(xiàn)尾扇邊緣發(fā)紅、水泡、潰爛、壞死等癥狀，高溫季節(jié)嚴(yán)重感染時(shí)可引起病蝦整個(gè)尾部潰爛甚至死亡。克氏原螯蝦細(xì)菌性疾病的病原菌種類繁多，其相關(guān)研究也十分廣泛，但關(guān)于早春季節(jié)克氏原螯蝦爛尾病的病原研究鮮有報(bào)道。2020年4月，江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)克氏原螯蝦出現(xiàn)爛尾癥狀，病蝦尾扇部位出現(xiàn)肉質(zhì)腫脹和灼燒狀疤痕，病蝦正常攝食，除尾扇邊緣潰爛外，體表和內(nèi)臟均無(wú)明顯病變，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察和PCR檢測(cè)排除真菌、寄生蟲(chóng)和病毒病原。為防止該病原繼續(xù)發(fā)展產(chǎn)生更大危害，筆者采集病蝦樣本并開(kāi)展相關(guān)研究，為克氏原螯蝦疾病預(yù)防提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1平均體質(zhì)量測(cè)定患病克氏原螯蝦取自江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)，共計(jì)4尾鮮活病蝦，平均體質(zhì)量約20g。健康克氏原螯蝦購(gòu)自揚(yáng)州市寶應(yīng)縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體質(zhì)量(20±1)g。1.2試劑和動(dòng)物用藥敏分析試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于南京便診生物技術(shù)有限公司；TaKaRaMiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于Solarbio公司；動(dòng)物用藥敏分析試劑板購(gòu)于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR引物也由該公司合成。1.3形態(tài)分離菌株的篩選取活體病蝦4尾，用無(wú)菌接種針蘸取尾部病灶組織于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,取優(yōu)勢(shì)菌落于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上多次分離純化，得到2株代表菌株。同時(shí)將單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中增菌24h,保存?zhèn)溆谩?.4菌株分離菌將健康克氏原螯蝦分成2個(gè)試驗(yàn)組，分別感染2株分離菌。每個(gè)試驗(yàn)組分設(shè)5個(gè)小組，包括3個(gè)感染組和2個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行投放8尾蝦。3個(gè)感染組分別加入1×101.5細(xì)菌的鑒定1.5.1細(xì)菌形態(tài)特征觀察觀察培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)，并對(duì)純化培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色，置于1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。同時(shí)測(cè)定病原菌蔗糖、半乳糖、尿素、精氨酸、賴氨酸等生理生化指標(biāo)。1.5.2細(xì)菌通用引物序列取純化培養(yǎng)的新鮮菌液，按照試劑盒操作說(shuō)明分別提取2種細(xì)菌的DNA,用細(xì)菌通用引物序列F:5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3′和R:5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′1.5.3gyrb基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建將分離菌的gyrB基因序列提交BLAST檢索系統(tǒng)比對(duì)，選擇相似度較高的菌株基因序列，使用MEGA7軟件鄰接法構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(自展1000次)。1.6細(xì)菌相關(guān)特征的分析1.6.1引物序列的分析DNA提取方法相同，定居因子CFA基因引物序列為F:5′-TCCAGCGCATTCA-3′和R:5′-TCCAGCCTTCGGCAAACG-3′1.6.2ccagcgcgctctacrt-3模型DNA提取方法相同，幾丁質(zhì)酶chi基因引物序列為F:5′-CCAGGCGCCGTGGARRTCRTANSWCA-3′和R:5′-CGTGGACATCGACTGGGARTWYCC-3′1.6.3藥物敏感性分析試驗(yàn)使用藥敏分析試劑板，對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素和甲砜霉素等8種常見(jiàn)抗菌藥進(jìn)行藥物敏感性分析，篩選有效抗菌藥物。參照微量二倍稀釋法測(cè)定藥物最低抑菌質(zhì)量濃度，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[13]。2結(jié)果2.1細(xì)菌的分離自患病克氏原螯蝦病灶部位(圖1a)分離出2株具有不同形狀和色澤的代表菌株，分別編號(hào)為L(zhǎng)W2047-1和LW2047-2。2.2人工感染試驗(yàn)2.2.1高密度感染組人工感染后飼養(yǎng)10d,菌株LW2047-1的感染組和對(duì)照組均無(wú)爛尾癥狀，高密度感染組出現(xiàn)少量死亡，死亡個(gè)體無(wú)爛尾癥狀。菌株LW2047-2各密度感染組均出現(xiàn)爛尾癥狀，平均發(fā)病率分別為70.8%、54.2%和45.8%,對(duì)照組1的平均發(fā)病率為25%,對(duì)照組2未出現(xiàn)爛尾癥狀(表1)。2.2.2肝胰腺組織病理學(xué)檢測(cè)在飼養(yǎng)過(guò)程中，菌株LW2047-2感染組病蝦癥狀與采集的病蝦樣癥狀相似，病蝦可以正常攝食，早期尾扇剪切部位出現(xiàn)潰爛和肉質(zhì)囊腫，后期結(jié)痂形成灼燒狀疤痕(圖1b～d)。在未剪切尾扇的對(duì)照組1中同樣有小部分蝦產(chǎn)生尾部潰爛癥狀，癥狀相對(duì)較輕(圖1e)。在高密度組中有多尾蝦嚴(yán)重感染后死亡，在死亡蝦尾扇、肝胰腺、鰓和肌肉等組織中均能分離出該種細(xì)菌，死亡個(gè)體肝胰腺顏色正常，但有蛻殼未遂癥狀(圖1f)。感染試驗(yàn)結(jié)束后，從感染組病蝦尾部再次分離到與菌株LW2047-2特征相同的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，克氏原螯蝦爛尾病病原為菌株LW2047-2。2.3細(xì)菌的鑒定2.3.1油亮紫外光光譜分離菌株LW2047-2的菌落為圓形，乳白色，邊緣薄，直徑為1～2mm,油亮反光(圖2a)。該菌為革蘭氏陰性菌，短桿狀，兩邊鈍圓，分散排列，偶爾出現(xiàn)菌體黏結(jié)成長(zhǎng)條狀，以單個(gè)菌體或多個(gè)菌體聚集成團(tuán)居多(圖2b)。2.3.2生理生化特征生化鑒定結(jié)果顯示，菌株LW2047-2各項(xiàng)理化指標(biāo)符合檸檬酸桿菌(2.3.3srrna基因序列分析菌株LW2047-2的16SrRNA基因經(jīng)測(cè)序后，得到長(zhǎng)度為495bp的有效序列，將基因序列提交BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株16SrRNA基因與弗氏檸檬酸桿菌I-M-5-3、CX-100和78B-3相似性最高，達(dá)到99.35%,但與檸檬酸桿菌屬其他幾種菌株的相似性也較高(>98.91%)(表3)。2.3.4gyrb基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建菌株LW2047-2的gyrB基因經(jīng)測(cè)序后，得到長(zhǎng)度為1144bp的有效序列。選擇嗜水氣單胞菌作為外群模式菌，構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示，菌株LW2047-2與一株弗氏檸檬酸桿菌歸為一支。2.4細(xì)菌相關(guān)特征的分析2.4.1帶，陰性對(duì)照CFA基因引物擴(kuò)增出約100bp的清晰條帶，陰性對(duì)照為無(wú)菌水(圖4a)。檢測(cè)結(jié)果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有定居因子基因CFA,可以表達(dá)產(chǎn)生毒力因子黏附素。2.4.2條帶及嫌犯的關(guān)系chi基因引物擴(kuò)增出的條帶大小約為250bp,引物特異性好，無(wú)雜帶，條帶大小與目的片段一致，陰性對(duì)照為無(wú)菌水(圖4b)。檢測(cè)結(jié)果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有幾丁質(zhì)酶基因chi,可以表達(dá)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。2.4.3d-2藥物敏感性檢測(cè)利用藥敏分析試劑板測(cè)定弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2的藥物敏感性(表4)。結(jié)果表明，該菌株對(duì)恩諾沙星和硫酸新霉素高度敏感，對(duì)磺胺類藥物不敏感，對(duì)氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素中度敏感。3討論3.1革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌弗氏檸檬酸桿菌屬腸桿菌科，菌體呈桿狀，半透明或不透明，表面有光澤，邊緣不整齊，不產(chǎn)生吲哚，是一種革蘭氏陰性、氧化酶陰性的發(fā)酵產(chǎn)氣桿菌。該菌為條件致病菌，需氧或兼性厭氧，在光學(xué)顯微鏡下多為單個(gè)或雙個(gè)散狀排列，電鏡下可見(jiàn)其鞭毛，無(wú)芽孢和莢膜弗氏檸檬酸桿菌的毒力因子主要包括溶血素、內(nèi)毒素、蛋白水解酶、幾丁質(zhì)酶和黏附素3.2條件致病菌群弗氏檸檬酸桿菌作為人類腸道中的正常菌群，是一種兼性厭氧的條件致病菌。Barnes等弗氏檸檬酸桿菌作為魚(yú)類病原菌最早被報(bào)道于1982年，Sato等3.3病原菌的藥物敏感性在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗菌藥物可直接殺滅細(xì)菌，達(dá)到防病治病的效果，而不同細(xì)菌的藥物敏感度各不相同。因此，分析病原菌的藥物敏感性對(duì)疾病防控和養(yǎng)殖生產(chǎn)指導(dǎo)具有重要意義。陳紅蓮等4蝦體表面感染試驗(yàn)結(jié)果