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抗纖益心濃縮丸對擴張型心肌病大鼠心肌纖維化的影響
擴張性心肌病(cdm)是以左心室或雙室間收縮障礙為主要特征的心肌病,通常由心力衰竭引起。我國發(fā)病率為13~84/10萬,5~10年生存率約25%~50%,國外發(fā)病率為1/2500~1/250,男女比例3∶1臨床常規(guī)方案治療本病常不能取得良好的效果,而中醫(yī)藥對本病的治療具有獨特的優(yōu)勢??估w益心方是王振濤教授根據(jù)DCM的病機特點,在臨床治療中取得良好效果的方劑材料表面1.儀器、試劑和試劑盒SPF級4周齡健康雄性Wistar大鼠120只,體質(zhì)量(30±5)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)20160006。大鼠飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實驗室動物中心,12h日光燈照明,空調(diào)控溫。IVC獨立送風隔離籠具:CA25籠一拖二PSU觸摸型,超凈工作臺(型號:JBCJ2FC型),蘇州馮氏實驗動物設備有限公司;動物飲水機(型號:MasterQ型),上海和泰儀器有限公司;超速低溫離心機(型號:SIGMA3K),美國SigmaAldrich公司;超聲診斷系統(tǒng):ACUSONCypress,配備有西門子acuson7L3型探頭。凝膠電泳儀,美國伯樂;光學顯微鏡,日本OLYMPUS公司;攝影顯微鏡,德國萊卡公司;手術剪刀、鑷子、止血鉗等器械,以上儀器均由河南省中醫(yī)院中心實驗室統(tǒng)一提供。Masson三色染色試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;Ⅰ、Ⅲ兔多克隆抗體,武漢博士德生物工程有限公司;PV9000試劑盒,北京中杉生物工程有限公司;DAB試劑盒,北京中杉生物工程公司;BCA蛋白定量試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)、GDAPH的一抗及HRP標記的二抗,美國SantaCruz公司;水合氯醛,天津市光復精細化工研究所,批號:20130309。KYP由河南中醫(yī)藥大學藥學院制劑室提供,主要由黃芪30g,紅參12g,益母草15g,丹參15g,澤蘭15g,麥冬15g,升麻9g,茯苓15g,白術15g組成??ㄍ衅绽ㄒ?guī)格:25mg/片,上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號:63170904);呋喃唑酮片(0.1g/片,天津力生制藥股份有限公司,批號:1803011)。分組及分組Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)3d,采用隨機數(shù)字表法,按7∶1隨機分為造模組和正常組。正常組常規(guī)飼養(yǎng),不作任何干預,造模組采用自主飲用呋喃唑酮水溶液(按1kg水加700mg呋喃唑酮片配置)2.體質(zhì)量用藥量根據(jù)成人劑量換算得到灌胃劑量,大鼠每千克體質(zhì)量用藥量為成人每千克體質(zhì)量的6.3倍換算。KYP(高、中、低)劑量組分別灌胃KYP(10.20、5.10、2.55g·kg3.mahen染色各組大鼠藥物干預療程結(jié)束后,禁食12h,4%濃度的水合氯醛(0.8mL/100g)腹腔注射麻醉,麻醉后,迅速開胸取出心臟,用0.9%氯化鈉溶液充分沖洗心臟殘血,紗布吸干水分,分離心室,再沿室壁剪開,分離左心室,取左心室的橫截面小塊心肌組織置于4%多聚甲醛固定,備用于Masson染色和免疫組化,其余左心室心肌組織,立即放入液氮中,隨后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.mahen染色取經(jīng)4%的多聚甲醛固定好的心肌組織,經(jīng)脫水、透明、進蠟、包埋、切片,進行Masson染色,在顯微鏡下膠原纖維呈藍紫色,心肌纖維呈紅色。每個標本選取5個視野,使用Image-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析心肌膠原容積分數(shù)(collagenvolumefraction,CVF)。5.免疫組化法對三級心肌組織的形成和i型膠原心肌組織石蠟切片脫蠟至水,PBS洗3×5min,檸檬酸抗原修復10min,自然冷卻,PBS浸泡5min,3次(3×5min),3%H6.凝膠成像分析分別稱取各組大鼠心肌組織100mg,加入RIPA裂解液,在冰上研磨,4℃、12000r/min離心10min(離心半徑27cm),BCA法測定蛋白濃度,以4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液,100℃5min,進行凝膠電泳和轉(zhuǎn)模,加入一抗4℃過夜,二抗37℃1h,TBST清洗后,使用凝膠成像系統(tǒng)曝光,經(jīng)軟件掃描后分析結(jié)果。以GAPDH為蛋白內(nèi)參,用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示蛋白行對表達量,重復實驗至少3次。7.統(tǒng)計方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行所有統(tǒng)計分析,計量資料以對心肌細胞間質(zhì)的影響見圖1、表1。正常組可見紅色的心肌細胞排列整齊緊密,間質(zhì)有少量藍色膠原纖維;模型組可見心肌間質(zhì)大量纖維化組織,心肌排列紊亂,大量膠原沉積,CVF顯著升高(P<0.01);與模型組比較,KYP高劑量組可見少量膠原纖維,CVF顯著降低(P<0.01),KYP中劑量組心肌間質(zhì)可見部分纖維組織,CVF較模型組明顯減少(P<0.01);KYP低劑量組間質(zhì)可見較多心肌纖維組織,CVF較模型組稍減少(P<0.05);卡托普利組接近正常組,肌纖維間隙較正常組稍寬,CVF較模型組明顯減少(P<0.01)。正常組心肌細胞間質(zhì)有少量Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達,模型組大部分區(qū)域纖維化,部分心肌纖維變性斷裂明顯,可見棕黃色的膠原反復重疊排列,有大量的膠原增生,KYP高劑量組和卡托普利組間質(zhì)纖維組織稍有增生,膠原增生不明顯,KYP中劑量組間質(zhì)纖維組織增生,膠原增生比模型組明顯減少,KYP低劑量組心肌纖維萎縮、斷裂、變性,間質(zhì)纖維組織明顯增生,膠原增生比模型組減少(見圖2-圖3)。模型組大鼠心肌組織光密度值明顯增加(P<0.01),而KYP各劑量組及卡托普利組較模型組明顯降低(P<0.01),見表2。見圖4。與正常組比較,模型組α-SMA、CTGF蛋白表達明顯增高(P<0.01);與模型組比較,KYP高劑量組、KYP中劑量組、卡托普利組α-SMA、CTGF蛋白表達降低(P<0.05,P<0.01),表明KYP中劑量、KYP高劑量和卡托普利可降低心肌組織α-SMA、CTGF蛋白的表達。不同藥物干預dcm大鼠心肌纖維化的效果中醫(yī)理論認為DCM的病機以正氣虛為根本原因,標實責之瘀血、水濕、外邪等。初期以心氣虧虛為主,氣虛日久傷及心陽,后期往往多臟腑功能失調(diào),其中氣虛血瘀存在于病變發(fā)展過程中的各個環(huán)節(jié),故益氣活血為治療的根本大法DCM心肌纖維化的主要機制是心肌成纖維細胞的增殖、肌成纖維細胞活化和膠原蛋白的代謝紊亂本研究發(fā)現(xiàn),DCM大鼠心肌組織中α-SMA、CTGF蛋白表達明顯高于正常組,同時伴有心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增多,心肌纖維化明顯,說明心肌成纖維細胞分化參與DCM心肌纖維化的過程中。而各藥物干預組的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量降低,且改善心肌纖維化病理,抑制α-SMA、CTGF蛋白表達水平。說明KYP可抑制心肌成纖維細胞分化所引起的心肌纖維化表現(xiàn),其機制可能是抑制了與
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