抗纖益心濃縮丸對擴張型心肌病大鼠心肌纖維化的影響

抗纖益心濃縮丸對擴張型心肌病大鼠心肌纖維化的影響

擴張性心肌病（cdm）是以左心室或雙室間收縮障礙為主要特征的心肌病，通常由心力衰竭引起。我國發(fā)病率為13～84/10萬，5～10年生存率約25%～50%，國外發(fā)病率為1/2500～1/250，男女比例3∶1臨床常規(guī)方案治療本病常不能取得良好的效果，而中醫(yī)藥對本病的治療具有獨特的優(yōu)勢?？估w益心方是王振濤教授根據(jù)DCM的病機特點，在臨床治療中取得良好效果的方劑材料表面1.儀器、試劑和試劑盒SPF級4周齡健康雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量（30±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）20160006。大鼠飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實驗室動物中心，12h日光燈照明，空調(diào)控溫。IVC獨立送風隔離籠具：CA25籠一拖二PSU觸摸型，超凈工作臺（型號：JBCJ2FC型），蘇州馮氏實驗動物設備有限公司；動物飲水機（型號：MasterQ型），上海和泰儀器有限公司；超速低溫離心機（型號：SIGMA3K），美國SigmaAldrich公司；超聲診斷系統(tǒng)：ACUSONCypress，配備有西門子acuson7L3型探頭。凝膠電泳儀，美國伯樂；光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；攝影顯微鏡，德國萊卡公司；手術剪刀、鑷子、止血鉗等器械，以上儀器均由河南省中醫(yī)院中心實驗室統(tǒng)一提供。Masson三色染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Ⅰ、Ⅲ兔多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；PV9000試劑盒，北京中杉生物工程有限公司；DAB試劑盒，北京中杉生物工程公司；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、結(jié)締組織生長因子（connectivetissuegrowthfactor,CTGF）、GDAPH的一抗及HRP標記的二抗，美國SantaCruz公司；水合氯醛，天津市光復精細化工研究所,批號：20130309。KYP由河南中醫(yī)藥大學藥學院制劑室提供，主要由黃芪30g，紅參12g，益母草15g，丹參15g，澤蘭15g，麥冬15g，升麻9g，茯苓15g，白術15g組成?？ㄍ衅绽ㄒ?guī)格：25mg/片，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：63170904）；呋喃唑酮片（0.1g/片，天津力生制藥股份有限公司，批號：1803011）。分組及分組Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)3d，采用隨機數(shù)字表法，按7∶1隨機分為造模組和正常組。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何干預，造模組采用自主飲用呋喃唑酮水溶液（按1kg水加700mg呋喃唑酮片配置）2.體質(zhì)量用藥量根據(jù)成人劑量換算得到灌胃劑量，大鼠每千克體質(zhì)量用藥量為成人每千克體質(zhì)量的6.3倍換算。KYP（高、中、低）劑量組分別灌胃KYP(10.20、5.10、2.55g·kg3.mahen染色各組大鼠藥物干預療程結(jié)束后，禁食12h,4%濃度的水合氯醛（0.8mL/100g）腹腔注射麻醉，麻醉后，迅速開胸取出心臟，用0.9%氯化鈉溶液充分沖洗心臟殘血，紗布吸干水分，分離心室，再沿室壁剪開，分離左心室，取左心室的橫截面小塊心肌組織置于4%多聚甲醛固定，備用于Masson染色和免疫組化，其余左心室心肌組織，立即放入液氮中，隨后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.mahen染色取經(jīng)4%的多聚甲醛固定好的心肌組織，經(jīng)脫水、透明、進蠟、包埋、切片，進行Masson染色，在顯微鏡下膠原纖維呈藍紫色，心肌纖維呈紅色。每個標本選取5個視野，使用Image-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析心肌膠原容積分數(shù)（collagenvolumefraction,CVF）。5.免疫組化法對三級心肌組織的形成和i型膠原心肌組織石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3×5min，檸檬酸抗原修復10min，自然冷卻，PBS浸泡5min,3次（3×5min),3%H6.凝膠成像分析分別稱取各組大鼠心肌組織100mg，加入RIPA裂解液，在冰上研磨，4℃、12000r/min離心10min（離心半徑27cm),BCA法測定蛋白濃度，以4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，100℃5min，進行凝膠電泳和轉(zhuǎn)模，加入一抗4℃過夜，二抗37℃1h,TBST清洗后，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光，經(jīng)軟件掃描后分析結(jié)果。以GAPDH為蛋白內(nèi)參，用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示蛋白行對表達量，重復實驗至少3次。7.統(tǒng)計方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行所有統(tǒng)計分析，計量資料以對心肌細胞間質(zhì)的影響見圖1、表1。正常組可見紅色的心肌細胞排列整齊緊密，間質(zhì)有少量藍色膠原纖維；模型組可見心肌間質(zhì)大量纖維化組織，心肌排列紊亂，大量膠原沉積，CVF顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，KYP高劑量組可見少量膠原纖維，CVF顯著降低（P<0.01),KYP中劑量組心肌間質(zhì)可見部分纖維組織，CVF較模型組明顯減少（P<0.01);KYP低劑量組間質(zhì)可見較多心肌纖維組織，CVF較模型組稍減少（P<0.05）；卡托普利組接近正常組，肌纖維間隙較正常組稍寬，CVF較模型組明顯減少（P<0.01）。正常組心肌細胞間質(zhì)有少量Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，模型組大部分區(qū)域纖維化，部分心肌纖維變性斷裂明顯，可見棕黃色的膠原反復重疊排列，有大量的膠原增生，KYP高劑量組和卡托普利組間質(zhì)纖維組織稍有增生，膠原增生不明顯，KYP中劑量組間質(zhì)纖維組織增生，膠原增生比模型組明顯減少，KYP低劑量組心肌纖維萎縮、斷裂、變性，間質(zhì)纖維組織明顯增生，膠原增生比模型組減少（見圖2-圖3）。模型組大鼠心肌組織光密度值明顯增加（P<0.01），而KYP各劑量組及卡托普利組較模型組明顯降低（P<0.01），見表2。見圖4。與正常組比較，模型組α-SMA、CTGF蛋白表達明顯增高（P<0.01）；與模型組比較，KYP高劑量組、KYP中劑量組、卡托普利組α-SMA、CTGF蛋白表達降低（P<0.05,P<0.01），表明KYP中劑量、KYP高劑量和卡托普利可降低心肌組織α-SMA、CTGF蛋白的表達。不同藥物干預dcm大鼠心肌纖維化的效果中醫(yī)理論認為DCM的病機以正氣虛為根本原因，標實責之瘀血、水濕、外邪等。初期以心氣虧虛為主，氣虛日久傷及心陽，后期往往多臟腑功能失調(diào)，其中氣虛血瘀存在于病變發(fā)展過程中的各個環(huán)節(jié)，故益氣活血為治療的根本大法DCM心肌纖維化的主要機制是心肌成纖維細胞的增殖、肌成纖維細胞活化和膠原蛋白的代謝紊亂本研究發(fā)現(xiàn)，DCM大鼠心肌組織中α-SMA、CTGF蛋白表達明顯高于正常組，同時伴有心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增多，心肌纖維化明顯，說明心肌成纖維細胞分化參與DCM心肌纖維化的過程中。而各藥物干預組的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量降低，且改善心肌纖維化病理，抑制α-SMA、CTGF蛋白表達水平。說明KYP可抑制心肌成纖維細胞分化所引起的心肌纖維化表現(xiàn)，其機制可能是抑制了與