骨組織總蛋白提取方法的比較研究

骨組織總蛋白提取方法的比較研究

目前，許多問題，如骨折愈合、骨腫瘤發(fā)生機制、組織工程修復骨缺損的機制等。以往對于難以處理的組織蛋白的提取主要采用單純研磨法,但該方法處理骨組織的具體過程目前報道有限,這對于推廣骨組織蛋白的研究是不利的.同時,Melissa、Jiang、聶敏、劉建仁等1材料和方法1.1實驗動物清潔級新西蘭大白兔8只,雌雄不限,體重約2.5kg(由南方醫(yī)院動物實驗中心提供)1.2實驗細胞和儀器蛋白裂解液、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、牛血清蛋白(BSA)、30%丙烯酰胺、Tris堿、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、TEMED、甲醇、PVDF膜、吐溫-20、脫脂奶粉、PBS、預染marker(購自碧云天)、Beta-actin一抗(購自santa)、羊抗小鼠-IGg(購自北京中杉,ZB-2305)、ECL(購自Pirece)、柯達X-OMTBT膠片、錘式組織粉碎器(CP-50W,圖1)、紫外/核酸蛋白檢測儀(NanoDrop,ND-1000),垂直電泳儀(BAYGENE).1.3蛋白質(zhì)的提取在局麻條件下解剖出兔雙側(cè)股骨,利用鋸條將兔股骨干分成數(shù)塊,每塊長約1.5mm,共30份,剔除骨外膜,用PBS將髓腔沖洗干凈,再用錫紙包裹骨組織.先將骨組織置于-75℃冰箱中12h,再投入液氮中保存.為了比較幾種物理提取法,即單純研磨法、單純錘擊法和錘擊研磨法提取蛋白的效果,將之前保存的骨組織隨機分為3組,各組10份,分別進行下述處理,整個操作過程由2人協(xié)同完成,另由1人對骨組織破碎過程中所需時間和液氮消耗量進行記錄,事先未告知記錄人實驗具體分組情況.1.3.1蛋白裂解蛋白提取液取出任意10塊骨組織后,迅速對其進行稱重,然后將骨組織轉(zhuǎn)入裝有液氮的研缽中,利用研磨法將骨組織磨成粉末狀,期間需保證液氮不完全揮發(fā),然后將粉末狀骨組織收集到1.5mL的EP管中.隨后為各方法的共有步驟,即向EP管中加入蛋白裂解液(按每100mg骨組織加入200μL裂解液),在冰上裂解骨組織30min.用加樣槍吸取EP管中的裂解液至另一EP管中,12000轉(zhuǎn),4℃離心15min,取上清即為含有總蛋白的提取液.提取液可在-70℃冰箱中保存.1.3.2錘擊加擊破碎骨組織從液氮中取出任意10塊骨組織,迅速對其進行稱重,然后將骨組織塊轉(zhuǎn)入裝有液氮的專用金屬小容器中,利用壓縮破碎的原理,用錘式組織粉碎器在將骨組織擊打成細小的碎塊狀(只需錘擊一次便可達到效果).在液氮尚未完全揮發(fā)前,用藥勺將骨組織碎塊放入1.5mL的EP管中,其后操作步驟同上.1.3.3研磨法研磨法剩余10塊骨組織在稱重后,采用錘式組織粉碎器擊打,迅速將骨組織轉(zhuǎn)入裝有液氮的研缽中,利用研磨法將骨組織碎塊磨成粉末狀,期間需保證液氮不完全揮發(fā),然后將粉末狀骨組織收集到1.5mL的EP管中,其后操作步驟同上.1.4蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法測定提取液中的蛋白濃度1.5積層膠及分離膠的制備平衡各上樣孔的蛋白量,按每孔50μg上樣,配置12%分離膠和5%積層膠,積層膠段采用70mV電流電泳約60min,分離膠段采用100mV電泳約120min或待溴酚藍跑至分離膠底部上1cm時終止電泳.將積層膠切去,然后分離膠用考馬斯亮藍R-250進行染色.1.6pvdf膜的轉(zhuǎn)膜和顯色實驗取電泳后獲得的SDS膠按濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜.根據(jù)Marker指示,由于Beta-actin的相對分子質(zhì)量在43kD,所以截取相對分子質(zhì)量在49~35kD范圍內(nèi)的SDS膠,然后采用200mA電流轉(zhuǎn)膜90min.PVDF膜轉(zhuǎn)膜前要先用甲醇浸泡30s,然后用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡5min.轉(zhuǎn)膜后將膜取出,用含5%脫脂奶粉的封閉液4℃封閉過夜,室溫下在封閉液中孵Beta-actin一抗和羊抗小鼠-IGg各2h,用TBST洗膜后通過ECL法進行顯色,在暗室中顯影、定影.利用QuantityOnev4.6.2軟件對結(jié)果進行分析和比較.1.7骨組織蛋白的測定3種方法處理樣品所需時間(即從對骨組織進行破碎到加入裂解液前所需時間)、液氮量、獲得的蛋白濃度和相應的灰度值用x±s表示,用SPSS13.0軟件,利用方差分析對3種提取法所獲得的骨組織蛋白濃度和灰度值進行分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異.2結(jié)果2.13研磨法與液氮法提取蛋白所需時間的比較對3種方法處理樣品的時間、消耗的液氮情況進行檢測和統(tǒng)計學分析.采用CP-50W破碎骨組織時,只需向小容器中加入約5mL的液氮.采用研缽操作時,在液氮揮發(fā)前,每次需向研缽內(nèi)加液氮約15mL.利用紫外/核酸蛋白檢測儀所得的蛋白濃度標準曲線公式為y=0.0147x,R經(jīng)統(tǒng)計學分析,單純錘擊法操作時間最短,液氮消耗最少,其次是錘擊研磨法,最后是單純研磨法.雖然3種提取法獲得的蛋白濃度均可達到Westernblot的研究要求,并且單純錘擊法操作更為快捷,液氮量消耗更少,但是該法所獲蛋白濃度較其他兩種方法低,P<0.05,而單純研磨法與錘擊研磨法所得的蛋白樣品濃度無統(tǒng)計學差異.2.2單純錘擊法組的蛋白豐度分離膠用考馬斯亮藍R250染色結(jié)果如圖2.可見117kD以上和19kD以下均有蛋白條帶分布.圖2中,1泳道為單純研磨法,2~4泳道為錘擊研磨法,5~8泳道為單純錘擊法.可見在單純錘擊法組中,蛋白主要集中在49kD以上的蛋白,49kD以下的蛋白豐度較低;在錘擊研磨法組中,各種相對分子質(zhì)量的蛋白均可見,且小相對分子質(zhì)量的蛋白明顯比單純錘擊組要高,總體分離效果與1泳道的單純研磨法組相當.2.3號孔為錘擊研究法各種提取法所得Beta-actin的Westernblot的結(jié)果見圖3.1號孔為單純研磨組,2~4號孔為錘擊研磨組,5~8號孔為單純錘擊組,利用QuantityOnev4.6.2軟件和SPSS13.0分析(表2).統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示單純研磨法與錘擊研磨法通過Westernblot法分析所得蛋白濃度的灰度值無統(tǒng)計學差異,但單純錘擊法的蛋白濃度的灰度值明顯比前兩者要低,P<0.05.3骨組織蛋白的提取和檢測骨組織由骨基質(zhì)和成骨細胞、破骨細胞、骨細胞等共同構(gòu)成.其中,骨基質(zhì)由兩部分組成,包括無機部分主要為羥基磷灰石,占骨基質(zhì)的65%~70%;有機部分主要為膠原和蛋白聚糖,占骨基質(zhì)的25%~30%,另有小部分有機成分為非膠原蛋白,主要包括生長因子,細胞因子,骨特有蛋白等以往提出的對骨組織等較難處理組織的蛋白提取方法主要是采取單純研磨法,由于骨組織硬度高,該方法操作起來初始研磨難度大,耗時長,損失液氮量大,不利于有效快速的提取蛋白和滿足大批量實驗的需求,所以有必要探索更為簡潔快速的物理提取方法,以利于開展骨組織的Westernblot研究.利用錘擊研磨法提取蛋白的整個過程通常只需加液氮2~3次,每次5mL就足夠了.由于初期采用CP-50W將骨組織擊碎,所以給后來的研磨操作提供了方便,錘擊后只需將骨組織研磨30s左右便能將骨組織研成粉末狀,這比單純研磨更省力省時,同時還能節(jié)省液氮的用量,而且結(jié)果顯示該法提取蛋白質(zhì)的效果與單純研磨效果無統(tǒng)計學差異,并且能保證49kD以下蛋白質(zhì)的豐度.Melissa等Jiang等在采用了單純錘擊法破碎的10份蛋白樣品中,雖然上樣前已將各孔蛋白含量均調(diào)整為每孔50μg,但是電泳圖(圖2)可見49kD以下蛋白含量明顯較其它兩種方法少,后期Westernblot結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)Beta-actin的檢出量也要比單純研磨組和錘擊研磨組要低.這可能是由于采用單純錘擊法時未能像研磨法一樣,將骨組織研磨至足夠粉碎,導致加入蛋白裂解液后,裂解液不能與所有組織充分接觸,以至49kD以下蛋白提取不完全而出現(xiàn)上述結(jié)果.這些結(jié)果對于骨組織蛋白的提取和檢測給予了一些重要提示.首先,在骨組織蛋白提取時,應注意盡量將骨組織充分研碎,這樣才能保證低相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)的提取和提取樣品的質(zhì)量.同時研磨時要注意及時添加液氮,以防止蛋白損失.其次,在進行Westernblot研究中,若要采用Beta-actin作為內(nèi)參,則應盡量采用同樣的物理提取方法,這樣才能保證后期結(jié)果的可比性.在本實驗中,采用不同方法提取蛋白,雖然上樣前平衡了蛋白含量,但是得出的Beta-actin的表達情況存在差別,這會影響后期目標蛋白的比較結(jié)果.在本實驗中曾提取凍存時間較長的兔股骨組織利用研磨法提取蛋白和進行Westernblot研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白降解比新鮮骨組織明顯,R250考馬斯亮藍染色后條帶模糊不清,顯影后Betaactin的條帶也不如新鮮骨組織蛋白的清楚,所以在此強調(diào)提取新鮮骨組織進行研究是十分重要的,這一點與劉建仁等4研磨法:投資生物過程中,本方法通過研磨法檢測細胞蛋白表達,將本方法通過東盟通過本實驗向大家提供了提取體內(nèi)骨組織蛋白用于Westernblot研究的基本物理