電鏡超薄切片

電鏡超薄切片第1頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凍蝕刻法超薄切片第5頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凍蝕刻法冷凍割斷術第6頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞化學法第7頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組織化學技術免疫電鏡法第8頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月電鏡放射自顯影術放射自顯影技術第9頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描電鏡技術被吞噬的紅細胞第10頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)有的透射電鏡生物制品制備技術分為兩類：一類是透射電鏡的基本制備技術，包括超薄切片和負染色法；另一類是生物制品的特殊技術，其中包括冷凍蝕刻法、冰凍割斷術、細胞化學法、免疫電鏡法、放射自顯影技術、X線微區(qū)分析技術等。第11頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1、

超薄切片樣品的制備（1）

取材基本要求是在活體情況下進行取材的原則(快、準、輕、小、冷的原則）1）

快速：1分鐘之內(nèi)投入固定液。2）

塊?。?.5-1mm3或截面1mm2的長條。3）

部位準4）

損傷?。浩餍祽J利，避免牽拉、擠壓，防止組織受機械損傷。5）

低溫：0-4oC第12頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月取材的方法1）動物材料：對神經(jīng)組織等要進行原位固定或灌注固定，待組織適當硬化后再取材。第13頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎干細胞的研究第14頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2）培養(yǎng)細胞：生長在瓶中的細胞到足夠的量，先倒去培養(yǎng)液，然后倒入適量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分鐘、彎頭吸管吹打或用軟器械輕輕地刮下貼壁的細胞，將這種混合液倒入離心管中，2000rpm低速離心15-20分鐘，使細胞呈團，棄去上清液，換一次固定液，將其移入修塊臺，修快成標準塊4oC固定、待用。第15頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3）單細胞懸液：精子、血球等其他不易聚集的懸浮游離材料，可加入等量的戊二醛和其他類型的固定液，輕輕地把他們懸浮在固定液中。經(jīng)過固定處理后再離心成團，在50oC中棄去上清液，加入適量的經(jīng)50oC預溫的2%的瓊漿，使團懸浮，將懸浮團和瓊脂液一同在薄片上展層，固定后切成1mm3的小塊。第16頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）固定固定的目地是把細胞在活體狀態(tài)時的結構盡可能完整的保存下來，避免自身酶的分解而出現(xiàn)自溶，或外界微生物的侵入而產(chǎn)生腐敗，致細胞的超微結構破壞。第17頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1）固定液的作用

A．阻止細胞自溶。B穩(wěn)定細胞物質(zhì)成分。C在一些組分的分子之間以化學反應和物理反應建立鉸鏈，提供一個骨架來穩(wěn)定各種細胞的空間結構。D能提供一定的電子反差

第18頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

理想的固定劑，應具備以下條件：①能迅速而均勻地滲入組織細胞內(nèi)部，穩(wěn)定細胞內(nèi)各種成分；②能即刻將細胞“殺死”，盡可能保持細胞微細結構，減少死后變化；③對細胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用，不產(chǎn)生人工假象及變形；④可保存酶的活性，以利于細胞化學測定工作的進行。第19頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2）影響固定效果的因素固定液的酸堿度(pH值)①固定液的pH值②滲透壓③緩沖液的類型④固定的溫度和時間當前采用的是在0～4℃下固定1～4小時。第20頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3）常用的幾種固定劑A四氧化鋨（osmiumtetroxide,OsO4）亦稱鋨酸：鋨酸實際上不是酸，它的水溶液是中性的，為一種強氧化劑。0.5-1g包裝，淡黃色晶體。具有揮發(fā)性和毒性，在室溫下易揮發(fā)，其蒸氣對粘膜有刺激作用，在通風櫥內(nèi)徑相配制。第21頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

優(yōu)點①對蛋白質(zhì)和脂類固定較好。②對作為細胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，對核蛋白保護作用很好，因為在有機體內(nèi)核酸和碳水化合物與蛋白制成復合的形式，因此鋨酸幾乎和所有的細胞成分結合。③分子密度高，產(chǎn)生良好的反差，因此鋨酸固定本身也起到生物染色作用。缺點①不能固定糖元和核酸，對微管固定較差。②擴散慢，穿透能力差。③具有揮發(fā)性和粘膜毒性。④不適于進行細胞化學工作。第22頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）純的容易聚合，目前使用25%水溶液進口分裝。存放時間久了容易變質(zhì)，影響固定。優(yōu)點(1)對組織穿透力強。(2)能保存某些酶的活性，對糖元、細胞膜、核基質(zhì)等有較好的作用。(3)而且組織塊在溶液中可保存較長的時間，適用于進行超微細胞化學研究。第23頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月C甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉劑配制。其分子小，滲透力強，固定迅速，對酶的活性保存好。第24頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2）固定的方法A單固定法：對單細胞或固定液易于浸透的組織，一般單獨用1-2%四氧化鋨固定液固定1-2小時可達到固定的目地。B雙固定法：戊二醛（2.5%4oC2h）---鋨酸（1%4oC2h）。C原位固定和灌注固定：將動物麻醉、解剖進行原位固定。灌注固定：通過血液循環(huán)將醛類的固定液灌流到所需組織中。神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、腎臟。第26頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月附幾種常見固定劑的配制固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,對含水較多的組織可用PH值8.0，細菌、病毒可用PH值在7.0以下。0.

2mol/L磷酸緩沖液的配制磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O）2.6g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）29g重蒸水加到500ml

調(diào)PH到7.4第27頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月0.2mol/L二甲坤酸鹽酸緩沖液重蒸水25ml二甲坤酸鈉（Na(CH3)2AsO2.3H2O）2.14g0.

1mol/L鹽酸8ml重蒸水加至50ml調(diào)PH到7.4

第28頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月B固定液的配制鋨酸固定液的配制2%的鋨酸固定液的配制：清洗烘干器皿--1G鋨酸+50ml雙蒸水（棕色瓶）數(shù)日可用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或二甲坤酸鹽緩沖液配制的1%鋨酸固定液。2%的鋨酸緩沖液10ml0.2mol/L緩沖液10ml調(diào)節(jié)PH應為7.3-7.4第29頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml）0.411.6重蒸水（ml）4.643.40.2ml/L緩沖液（ml）555戊二醛最終濃度12.54調(diào)節(jié)固定液PH值到7.3-7.4第30頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）

脫水1）

清洗:固定后均用和固定液相同的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘2）

脫水：常用的脫水劑為乙醇和丙酮。乙醇引起組織中脂類物質(zhì)抽提較丙酮少，且不會使組織變硬、變脆，故為常用脫水劑，然乙醇不容易和用于包埋劑的環(huán)氧樹脂相混溶，因此在進入包埋劑之前常用中間劑環(huán)氧丙烷置換。第31頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月脫水程序如下表濃度50%70%90%100%時間10′-15′10′-15′10′-15′3次（每次10′-15′）溫度4oC4oC轉(zhuǎn)室溫室溫第32頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)驗：①脫水劑臨時配制。②濃度梯度上升。③脫水時間和濃度。④脫水時的連續(xù)性。⑤脫水劑的選擇。第33頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）浸透：其目的是通過脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑取代脫水劑，使其滲透到組織中去。

脫水和包埋劑的比例2:11:2純包埋劑時間1-2h2-3h2h溫度室溫室溫37oC溫箱第34頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)驗：①浸透時間。②浸透溫度。第35頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）

包埋：目的:包埋的目的是讓包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅硬的固體，成為細胞結構的支架，能夠承受切片的各種力的作用，有利于切薄片。包埋劑的性質(zhì):①粘度適中，有良好的切割性能。②能耐受電子束的轟擊，高溫不易升華、不變形。③透明度好。④對人無害。第36頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月包埋劑的種類①環(huán)氧樹脂類：目前國內(nèi)使用較多的環(huán)氧樹脂有進口的Epon812和國產(chǎn)的618。原理:環(huán)氧樹脂具有環(huán)氧基和羥基兩個主要化學反應基團，環(huán)氧基是線型聚合物的末端，易與其它含活性氫原子的化合物如胺類反應，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。而單體中的羥基能與酸酐結合，形成分子間的橫橋連接。因此，將環(huán)氧樹脂、胺類和酸酐三者按比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結構的交鏈狀聚合物。第37頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月這種聚合物收縮率小、均勻，組織損傷小，耐電子束的轟擊。包埋后可保存細胞內(nèi)的微細結構。其缺點是粘度較大，操作不便、切片較為困難，而且反差較弱。第38頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月②低粘度包埋劑(Spurr)

為適應臨床診斷電鏡的需要，目前低粘度包埋劑的應用已日趨廣泛。這是一種低粘度的樹脂，能較好地滲入組織內(nèi)部，對組織結構保存好，耐電子束轟擊，可廣泛應用于各種生物材料，尤其適宜于較致密的組織。第39頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月③水溶性包埋劑：

是進行細胞化學研究較理想的包埋劑。

原理:水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進行聚合，避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞，所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑。包埋劑:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(簡稱GMA)、聚乙二醇、Aquon等第40頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月④所加的固化劑，有十二烯基虎鉑酸酐（DDSA）和甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐（MNA）,增韌劑為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速劑為2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。第41頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1）

環(huán)氧樹脂的性能和配制：618樹脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化劑）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑劑）0.3ml2,4.6三苯酚稱DMP30（加速劑）0.1ml60oC烘箱內(nèi)加溫使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化劑、增塑劑、加速劑，邊加邊攪拌，最后充分攪拌10分鐘，至37oC溫箱中使氣泡逸出。

第42頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Epon812的配制A液：Epon81262mlDDSA(固化劑)100mlB液：Epon812100mlMNA(固化劑)89mlA液和B液分別配制，使用時用不同比例將二者混合后再加1.5%DMP-30(加速劑)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋塊的硬度。第43頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1）

包埋的方法第44頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)包埋①

將浸透在包埋劑的組織塊，轉(zhuǎn)移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋劑。②

把寫好標本塊編號的小紙條卷成環(huán)狀，放入囊中，插入包埋劑中。③

不加蓋，37oC過夜，這也就是純包埋劑浸透。④

次日，升溫到60oC48小時固化。⑤

固化完畢，關溫箱，自然冷卻。⑥

去掉外殼，取出組織包埋塊將組織包埋塊，存放在干燥器中。

第45頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月定向包埋：注意事項①防潮、干燥。②包埋劑要充分混勻。③防氣泡。④包埋后立即清洗器皿。⑤自身保護。⑥干燥器中存放包埋塊。

第46頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（6）切片1）選擇和清洗載網(wǎng)。常用的載網(wǎng)有圓形的銅網(wǎng)，細胞化學和免疫組織化學常用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)和銀絲網(wǎng)。直徑為3mm，目數(shù)為200-300

第47頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2）

支持膜的制備：①

福爾莫瓦膜：常用氯仿配制的0.2%-1.5%的聚乙烯醇縮甲醛液（formrar）。注：制膜時室內(nèi)的溫度小于60%，否則會出現(xiàn)白點。②

火棉膠膜：特點，火棉膠膜的機械強度比福爾莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸異戊酯溶液采用漏斗法和貼附法制膜。③

帕羅丁支持膜：目前國外比較常用，一般配制30%左右的帕羅丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉膠同。④

碳膜：炭膜的機械程度和穩(wěn)定性較好，適用于高分辨率的觀察，用真空噴鍍儀采用碳升華噴鍍法制備。⑤

復合膜：有機膜上噴鍍5-10nm的碳膜。⑥

微孔支持膜：高分辨率觀察使用。第48頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2）

包埋塊修整：修成四面錐體（45oC角）第49頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月5）超薄切片機的構造

6）切片操作

7）

切片厚度:灰色40-50nm

銀灰色50-70nm

金黃色70-90nm

紫色90nm以上第50頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月(7)染色1）

常用的電子染色劑醋酸鈾(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，對光不穩(wěn)定，儲存、染色最好閉光，變混則失效。廣泛使用，能產(chǎn)生較高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和結締組織纖維成分的反差；對糖分、分泌顆粒、溶酶體等也能染色，但對膜的結構染色較差。常用濃度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的時間：組織塊染色時間為1-2h或過夜。片染30min