抗wssv克氏原螯蝦膠體金免疫層析試紙條的優(yōu)化及初步應用

抗wssv克氏原螯蝦膠體金免疫層析試紙條的優(yōu)化及初步應用

白蝦病是由非標準白色斑點病毒（wssv）引起的疾病。在第三種和第三十二天內(nèi)，日本蝦的發(fā)病率可以達到100%。從1993年首次暴發(fā)以來，每年對日本蝦業(yè)造成重大的傷害。目前,生產(chǎn)實踐中較普遍的通過苗種檢疫、生態(tài)調(diào)控改善養(yǎng)殖環(huán)境、飼料中添加免疫增強劑等措施預防控制白斑病發(fā)生目前常用的病原檢測方法主要包括普通PCR、實時定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和膠體金免疫層析試紙條。普通PCR、實時定量PCR具有較高的靈敏度1材料和方法1.1病害蝦池sis患白斑病的中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)取自青島附近養(yǎng)殖場的患病蝦池。克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)購自青島某水產(chǎn)品批發(fā)市場?？筗SSV單抗雜交瘤細胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2由本實驗室制備1.2wssv純度取患白斑病中國明對蝦的鰓,每克蝦鰓加入TNE緩沖液(Tris-HCl1.566g,NaCl5.844g,EDTA-Na1.3細胞培養(yǎng)和滲透將-80℃凍存的抗WSSV雜交瘤細胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2放入37℃水浴中迅速融化,1000r/min離心3min,棄去上清液,加入1mL37℃的GIT細胞培養(yǎng)基(日本NihonSeiyaku公司),將細胞重懸、吹勻后,吸入24孔培養(yǎng)板中(Corning,USA),于37℃下4.5%CO取腹水按1∶2(V/V)加入乙酸緩沖液,逐滴加入辛酸(1mL腹水加33μL辛酸)攪拌30min,4℃靜置2h;經(jīng)12000r/min離心30min,上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后,加入1/10體積的0.1mol/LPBS,用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4,加入飽和硫酸銨溶液使其濃度為45%,冰浴下攪拌30min,4℃靜置2h;12000r/min離心30min,沉淀用適量0.01mol/LPBS溶解后在4℃下透析3~4次,每次約4h。SDS鑒定抗WSSV單抗的純度和類型,間接免疫熒光技術(shù)鑒定單抗的特異性,間接ELISA測定單抗的效價。1.4wssv膠體金免疫分析試劑包的優(yōu)化1.4.1試紙條的制備用相同的抗WSSV單克隆抗體溶液分別在3種型號的試紙條NC膜(WhatmanAE99、Whatman135、Whatman180,上海杰一生物公司)劃上檢測線,質(zhì)控線為羊抗鼠IgG(Sigma),待NC膜干燥后,浸沒在3%BSA中于37℃下封閉1h,PBST洗滌3次,每次5min,晾干。金標墊用金標抗體Au-2E6浸潤后于37℃下干燥。將塑料底板、標簽紙、樣品墊、金標墊、吸水紙、3種型號的NC膜分別組裝成3組試紙條。用這3組試紙條分別檢測相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作為陰性對照。1.4.2試紙條的制備制備金標抗體Au-2E6和Au-2A3,將Au-2E6和Au-2A3按不同體積比混合,A組為Au-2E6,B組為Au-2A3,C組、D組和E組Au-2E6和Au-2A3分別按1∶1、2∶1和1∶2混合。將5組金標抗體浸潤金標墊后干燥。使用1.4.1中確定的NC膜,將5種金標墊和其他試紙條耗材組裝成5組試紙條。用這5組試紙條檢測相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作為陰性對照。1.4.3檢測線抗體最適將單抗2A3、3B7、4G9、5D2按不同體積比混合,A組2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶1∶1∶1;B組2A3∶3B7∶4G9∶5D2=2∶4∶2∶1;C組2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶2∶1∶1;D組為3B7。將這4組混合單抗分別在1.4.1中確定的NC膜上劃出檢測線,用1.4.2中確定的金標抗體制備金標墊,組裝成4組試紙條。用這4組試紙條檢測相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作為陰性對照。1.5wssv檢測按照1.4確定的試紙條優(yōu)化條件制備WSSV膠體金免疫層析試紙條。將1.2中純化的WSSV溶液從10倍到20480倍按2倍等比稀釋成不同濃度的病毒溶液,用優(yōu)化的試紙條分別對其進行檢測,陰性對照為0.01mol/LPBS溶液。1.6wssv的培養(yǎng)實驗組和對照組各200只健康克氏原螯蝦(約20g/只)(PCR檢測無WSSV感染)暫養(yǎng)一周后,水溫逐漸升至25℃。實驗組投喂注射了WSSV的鮮活花蛤,對照組投喂不含WSSV的鮮活花蛤。感染后的96h內(nèi),每隔12h各隨機選擇8只活蝦,取鰓、血淋巴、腸、心臟、性腺、肌肉和肝胰腺。血淋巴按1∶1(V/V)加入抗凝劑;其余組織按每1g組織加入2mL0.01mol/LPBS冰浴研磨3~5min,4℃下4000r/min離心10min,取上清液,用試紙條進行檢測。2結(jié)果2.1間接免疫熒光結(jié)果2E6、2A3、3B7、4G9、5D2腹水經(jīng)純化后,單抗?jié)舛确謩e為10、5、8、4和2mg/mL。SDS結(jié)果顯示,5種單抗分別在50kDa和25kDa有清晰的條帶(見圖1),沒有明顯的雜帶,說明純化效果較好;且5種單抗均為IgG類型。間接免疫熒光結(jié)果顯示,2E6、2A3、3B7、4G9的熒光強度較強,5D2的熒光強度相對較弱;陰性對照無特異性熒光(見圖2)。間接ELISA結(jié)果顯示,單抗2E6、2A3、4G9的效價均為12800,3B7的效價為25600,5D2的效價為3200。2.2wssv膠體金免疫分析試劑包的優(yōu)化結(jié)果2.2.1wssv的測定3種型號的NC膜WhatmanAE99、Whatman135、Whatman180組裝的試紙分別檢測相同的WSSV溶液,結(jié)果顯示,WhatmanAE99的檢測線顯色最深,Whatman180次之,Whatman135的顯色最淺。說明WhatmanAE99制備的試紙條的靈敏度最高,因此確定WhatmanAE99作為WSSV膠體金免疫層析試紙條的NC膜。2.2.2金標抗體的確定金標抗體Au-2E6和Au-2A3按照不同的體積比混合后,分別制備5組試紙檢測相同的WSSV溶液,當Au-2E6∶Au-2A3按1∶1(V/V)混合時,試紙條檢測線顯色最深,因此確定WSSV膠體金免疫層析試紙條的金標抗體Au-2E6和Au-2A3按1∶1(V/V)混合。2.2.3檢測線抗體的混合比例抗WSSV單抗2A3、3B7、4G9、5D2按4種不同體積比混合后作為檢測線抗體,組裝的4組試紙條檢測相同的WSSV溶液,結(jié)果顯示,2A3∶3B7∶4G9∶5D2=2∶4∶2∶1(V/V)時,試紙條顯色明顯比其他3組更深(見圖3),因此確定2A3、3B7、4G9、5D2按2∶4∶2∶1比例混合作為WSSV膠體金免疫層析試紙條的檢測線抗體。2.3wssv檢測的優(yōu)化電鏡觀察發(fā)現(xiàn)純化的WSSV病毒粒子完整、數(shù)量較多、純度高(見圖4),考馬斯亮藍法測定WSSV溶液的蛋白濃度為1.2mg/mL。純化的WSSV溶液從10倍到20480倍按2倍等比稀釋成不同濃度的病毒溶液后,用優(yōu)化的試紙條檢測,結(jié)果顯示,隨著WSSV溶液稀釋倍數(shù)的增加,試紙條檢測線顯色由深紅色逐漸變淺;當純化的WSSV溶液稀釋倍數(shù)為10240倍時(WSSV蛋白濃度為117.2ng/mL),試紙條檢測線顯淺紅色,當純化的WSSV溶液稀釋倍數(shù)為20480倍時,試紙條檢測線不顯色。陰性對照的檢測線不顯色,所有試紙條的質(zhì)控線都為明顯的紅色。由此確定該試紙條的檢測限為117.2ng/mL(見圖5)。2.4感染wssv的克氏原螯蝦組織相關指標檢測結(jié)果感染W(wǎng)SSV后不同時間點,取克氏原螯蝦血淋巴及鰓、腸、心臟、性腺、肌肉、肝胰腺的粗提液用試紙條進行檢測。結(jié)果顯示,感染W(wǎng)SSV12h的克氏原螯蝦組織中,腸最先檢測為陽性;感染W(wǎng)SSV后24h時,鰓、血淋巴、腸、心臟、性腺、肝胰腺的檢測結(jié)果為陽性,肌肉檢測結(jié)果為陰性;36h時各組織的檢測結(jié)果均為陽性,其中試紙條檢測線顯色由深到淺的次序依次為腸、性腺、血淋巴、鰓、心臟、肝胰腺、肌肉(見圖6)。陰性對照組克氏原螯蝦各組織在不同時間的檢測結(jié)果均為陰性。3wssv膠體金免疫層析試紙條的制備WSSV的純度會影響試紙條檢測限的準確測定。如果純化的WSSV純度不高,其中的雜蛋白會使測得的WSSV濃度比實際濃度大,從而使試紙條的檢測限高于實際值。WSSV的囊膜比較脆弱,在純化過程中,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)病毒粒子的囊膜破損、脫落,不易得到完整的病毒粒子,有時純化的病毒溶液含有大量的雜質(zhì)。本文采用姜有聲等單克隆抗體的生產(chǎn)方法包括腹水法、實體瘤法和體外培養(yǎng)法,腹水法比實體瘤法和體外培養(yǎng)法有更多優(yōu)點。體外培養(yǎng)法獲得的雜交瘤上清液中單抗?jié)舛容^低;實體瘤法收集的血清中單抗的含量較高,但是獲得的血清量較少;采用腹水法生產(chǎn)單抗,每只小鼠可收集腹水5~10mL,且腹水中單抗?jié)舛容^高本文主要從NC膜、金標抗體和檢測線抗體3個方面對WSSV膠體金免疫層析試紙條進行了優(yōu)化。金標抗體在孔徑大的NC膜中的前進速度較快,但靈敏度較低;在孔徑小的NC膜中前進速度較慢,靈敏度較高,但孔徑太小容易產(chǎn)生假陽性。本文選擇WhatmanAE99NC膜制備的WSSV膠體金免疫層析試紙條,靈敏度較高,無假陽性?？紤]到試紙條實際使用過程中,待測樣品中可能含有少量不完整的病毒粒子,本文將2種分別抗WSSV囊膜蛋白和核衣殼蛋白的單抗混合后制備成金標抗體,能夠結(jié)合完整的病毒粒子和不完整的病毒粒子,從而提高試紙條的靈敏度。檢測線單抗的選擇也會影響試紙條的