克氏原螯蝦蛋白肽的制備及其抗氧化性研究

克氏原螯蝦蛋白肽的制備及其抗氧化性研究

克氏原刺蝦也被稱為龍眼，屬于淡水蝦。在分類上，它屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼素、沿海藻類和沿海藻類。20世紀(jì)90年代,人們將其引至我國各地養(yǎng)殖,現(xiàn)在廣泛分布在我國多個(gè)地區(qū),已經(jīng)成為許多地方的優(yōu)勢種群在食品儲(chǔ)存或加工過程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng),該反應(yīng)是食品中的還原糖與蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸或者含氮化合物之間發(fā)生的一種非酶褐變反應(yīng)本文以克氏原螯蝦加工副產(chǎn)物來源的蝦肽為原料,與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng),測定其產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)儀器和儀器克氏原螯蝦副產(chǎn)物采自江西海浩鄱陽湖水產(chǎn)有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase2.4FG)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical,DPPH)美國Sigma公司;氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、三氯化鐵、水楊酸、過氧化氫、硫酸、葡萄糖、果糖、乳糖,木糖,蔗糖等試劑均為分析純,購于南康市華億化工有限公司。上海標(biāo)本模型廠JJ-2高速組織搗碎機(jī);梅特勒-托利多DELTA-320精密pH計(jì);上海費(fèi)洽爾分析儀器有限公司TDL-5A離心機(jī);上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司UT-12電熱鼓風(fēng)干燥箱;上海嘉益電爐有限公司SX2-4-10箱式電爐;上海美譜達(dá)儀器有限公司UV-1000型紫外可見分光光度計(jì);西安常儀儀器設(shè)備有限公司水熱合成反應(yīng)釜;江西省金壇市榮華儀器制造有限公司HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋;上海亞榮生化儀器廠N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1蝦殼蛋白肽的制備克氏原螯蝦蛋白肽的制備參照本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果:將蝦殼副產(chǎn)物置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干,用粉碎機(jī)粉碎后密封、干燥保存。蝦殼副產(chǎn)物和水按1∶20的底物濃度稱取攪拌均勻后,按摩爾量添加2.5%Alcalase堿性蛋白酶,調(diào)節(jié)溶液pH至9.0,在55℃下水浴加熱,置于攪拌器中酶解反應(yīng)3h,酶解完成后于沸水浴中10min滅酶,冷卻至室溫,離心(8000×g,15min),取上清液,即為所制蛋白肽。取適量的蛋白肽,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮,調(diào)節(jié)濃度至實(shí)驗(yàn)需要的濃度。1.2.2蝦蛋白中的粗蛋白含量粗蛋白質(zhì)含量:凱氏定氮法,參考GB5009.5-2010。1.2.3蝦蛋白美德反應(yīng)的優(yōu)化1.2.3.蝦蛋白肽的轉(zhuǎn)移稱取等量不同種類的葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和蔗糖分別加到10mL濃度為30mg/mL的蝦蛋白肽中,調(diào)節(jié)體系pH為9.0后轉(zhuǎn)移到具塞試管中,蓋緊,密封。80℃水浴4h,立即放入冰水中冷卻,獲得的美拉德反應(yīng)液放置在4℃下保存,測定反應(yīng)產(chǎn)物的還原力,從中選出較佳的還原糖,平行測定三組。1.2.3.肽糖比對美拉德產(chǎn)物還原力和dpph自由基清除力的影響選取最優(yōu)還原糖后,采用單因素試驗(yàn)研究反應(yīng)時(shí)間、肽糖比、pH值、肽糖比對美拉德產(chǎn)物還原力和DPPH自由基清除力的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。1.2.3.3.正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化反應(yīng)條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH和肽糖比為單因素,每個(gè)因素確定三個(gè)較優(yōu)水平,按照L9(31.2.4通過測定和比較蛋白質(zhì)和成人劑的抗劑活性1.2.4.吸光度測定依次向試管中加入1mL稀釋100倍的樣品,再加入2.5mL0.2mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6),2.5mL1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50℃水浴鍋中靜止20min后冷卻至室溫,加入10%TCA2.5mL,離心(3000r/min,10min),取2.5mL上清液加入0.5mL0.1%三氯化鐵溶液和2.5mL蒸餾水,反應(yīng)15min后,700nm處測吸光值。1.2.4.dpph-乙醇溶液配制取2mL稀釋100倍的樣品溶液和2mL0.1mmol/LDPPH-乙醇溶液混合,在室溫下避光放置30min,于517nm下測其吸光度A1.2.4.樣品溶液依次加入1mL9mmol/L硫酸亞鐵、1mL稀釋30倍的樣品溶液、1mL8.8mmol/L過氧化氫溶液、1mL9mmol/L水楊酸-乙醇溶液,37℃水浴30min,510nm下測吸光度A2結(jié)果與分析2.1-2010年-2010年利用凱氏定氮法,參考GB5009.5-2010。測得蝦蛋白肽中粗蛋白的含量為52.85mg/ml,為方便實(shí)驗(yàn)將其準(zhǔn)確稀釋至30mg/ml,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。2.2蝦蛋白美德反應(yīng)條件的優(yōu)化2.2.1還原力試驗(yàn)與德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力比較按照1.2.3.1的方法測定糖的種類對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響。結(jié)果如圖1,木糖與蝦蛋白肽發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力最高,在700nm處的吸光度值可達(dá)到0.785,其次為葡萄糖,吸光值為0.768,兩者結(jié)果沒有顯著差異。WangWenqiong等利用乳清分離蛋白與六種糖(乳糖、蔗糖、木糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖)發(fā)生美拉德反應(yīng),發(fā)現(xiàn)乳清分離得到的蛋白質(zhì)與木糖反應(yīng)后獲得產(chǎn)物的抗氧化活性最高2.2.2反應(yīng)時(shí)間的影響由圖2可知,反應(yīng)時(shí)間在2-4h之間時(shí),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力隨著時(shí)間的延長呈線性增加。同樣,DPPH清除能力也由平穩(wěn)轉(zhuǎn)變?yōu)檠杆偕仙?而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過4h后,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力和DPPH清除能力都隨著時(shí)間的延長而趨于平穩(wěn)。這與趙靜、劉志和等人的研究結(jié)果基本一致2.2.3還原糖對h自由基清除能力的影響結(jié)果如圖3,隨著糖肽比的增加,蝦蛋白肽美拉德產(chǎn)物的還原力和DPPH自由基清除能力呈逐漸上升的趨勢,但當(dāng)加入的還原糖超過蛋白肽的3倍時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物的還原力增長滯緩。秦曉輝等人以木糖作為美拉德反應(yīng)還原糖,研究發(fā)現(xiàn)肽糖比對珍珠蚌多肽抗氧化能力影響在糖肽比為1∶3時(shí)達(dá)到最佳值2.2.5還原力和dpph清除率由圖5可知,在一定的溫度范圍內(nèi),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力和DPPH清除能力隨溫度升高而增加,當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)100℃以上時(shí),各組美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力和DPPH清除率呈顯著下降趨勢,這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致早期生成的具有抗氧化能力的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物被熱分解,從而使得產(chǎn)物抗氧化能力降低。趙晶等研究發(fā)現(xiàn),將酪蛋白與還原糖在不同的溫度條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng),溫度越高反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力就越高,在常壓的條件下,100℃為最佳的反應(yīng)溫度2.2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果通過單因素實(shí)驗(yàn),確定最佳反應(yīng)溫度為100℃,時(shí)間為4h,pH值為9,肽糖比為1∶3。在此基礎(chǔ)上,選擇溫度、pH值、時(shí)間、肽糖比為實(shí)驗(yàn)的單因素,設(shè)計(jì)L9(3通過正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知,各因素對蝦蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響不同,其主次順序?yàn)镈(肽糖比)>C(時(shí)間)>A(pH)=B(溫度),最優(yōu)的反應(yīng)條件組合為A2.3蛋白化合物與美德反應(yīng)產(chǎn)物的抗逆性2.3.1抗氧化活性的測定將蛋白肽稀釋至不同濃度0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL,測定其還原力、羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力,平行測定三組,結(jié)果見圖6。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)(0.2mg/mL-1.2mg/mL),蝦蛋白肽吸光度隨著濃度的增加而升高,還原力與樣品濃度的相關(guān)曲線為:y=0.48402x+0.00852(R2.4提高蛋白肽的抗氧化能力通過圖6和圖7可知,美拉德產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除力及DPPH自由基清除能力均比原始的蛋白肽溶液高,說明了美拉德反應(yīng)可以有效地增強(qiáng)蛋白肽的抗氧化能力。因此對蛋白肽與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化測定時(shí)其蛋白濃度范圍有一定的重疊,故選取相同蛋白濃度(0.2mg/mL)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,從而具體分析美拉德反應(yīng)對蛋白肽抗氧化性的影響強(qiáng)度。2.4.1還原能力的測定由圖8可知,美拉德反應(yīng)前的蝦蛋白肽的還原能力很低,美拉德反應(yīng)后蝦蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較高的還原能力。葡萄糖幾乎不具有還原能力,可以忽略不計(jì)。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.2mg/mL時(shí),蛋白肽700nm處的吸光度值為0.109,經(jīng)美拉德反應(yīng)后,其吸光度值為0.925。結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)可以極大的提高蝦蛋白肽的還原力,還原力為反應(yīng)前的8.367倍。2.4.2羥基自由基清除能力由圖9可知,蝦蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除羥自由基能力較強(qiáng),蝦蛋白肽清除羥自由基能力較低,葡萄糖幾乎不具有羥基自由基清除能力,可以忽略不計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)蝦蛋白肽濃度為0.2mg/mL時(shí),羥自由基清除能力為45.33%,經(jīng)美拉德反應(yīng)后,羥自由基清除能力為82.94%。因此,美拉德反應(yīng)可以提高蝦蛋白肽的羥自由基清除能力,羥自由基清除能力為反應(yīng)前的1.829倍。2.4.3葡萄糖dpph清除能力的測定由圖10可知,蝦蛋白肽具有一定的DPPH清除能力,蝦蛋白肽美拉德產(chǎn)物具有較高的DPPH清除能力,葡萄糖幾乎不具有DPPH清除能力,可以忽略不計(jì)。當(dāng)蝦蛋白肽濃度為0.2mg/mL時(shí),DPPH清除能力為40.33%,經(jīng)美拉德反應(yīng)后,DPPH清除能力為81.76%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)可以極大的提高蝦蛋白肽的DPPH清除能力,DPPH清除能力為反應(yīng)前的2.027倍。3最佳工藝條件的確定⑴還原糖的種類、肽糖比、反應(yīng)時(shí)間、pH值、反應(yīng)溫度均對反應(yīng)美拉德產(chǎn)物的抗氧化性有較大的影響,制備的蝦蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物最佳工藝條件:還原糖為葡萄糖;肽糖比為1∶3;pH值為9.0;反應(yīng)溫度為100℃;反應(yīng)時(shí)間為4h。在最佳工藝條件下,制備得到的美拉德產(chǎn)物的還原力為0.929,DPPH清除能力為87.75%。⑵相比于原料蝦蛋白肽,美拉德反應(yīng)后,蝦蛋白肽的抗氧化能力得到了極大地提升,還原力、羥自由基清除能力和DPPH清除能力分別為反應(yīng)前的8.367倍、1.829倍和2.027倍。2.2.4dpph自由基清除率反應(yīng)體系的pH對蛋白肽美拉德產(chǎn)物抗氧化性的影響結(jié)果見圖4。由圖可知,隨著反應(yīng)初始值pH的升高,生成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力先趨于不變后上升,當(dāng)始值pH大于9后吸光值趨于穩(wěn)定。而DPPH自由基清除率則是先緩慢下降,在pH大于9后下