克氏原螯蝦白斑綜合征病毒診斷及感染來源分析

克氏原螯蝦白斑綜合征病毒診斷及感染來源分析

近年來，由于消費需求的增加，克氏原蝦養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加。2009年6月，安徽某克氏原螯蝦(以下簡稱螯蝦)養(yǎng)殖場出現(xiàn)大批量螯蝦死亡，持續(xù)發(fā)病一周左右，初期病死率高峰期達到39%。2010年開始，該地區(qū)4個螯蝦養(yǎng)殖基地，1400畝蝦塘全部發(fā)病，近3年來已危害該地區(qū)所有的養(yǎng)殖基地，使養(yǎng)殖戶蒙受巨大的經(jīng)濟損失。在檢測送檢病料的基礎(chǔ)上，通過動物回歸試驗，結(jié)合電子顯微鏡觀察，診斷本次克氏原螯蝦病害的病原，追蹤分析了可能的感染源。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蝦苗蝦種病害送檢樣品來自安徽省某螯蝦養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖場自2007年引進蝦苗，后期采取自繁自養(yǎng)經(jīng)營模式，無發(fā)病史。2009年5月，養(yǎng)殖場其中某養(yǎng)殖池發(fā)現(xiàn)部分螯蝦死亡，一周后臨近6個蝦池全部出現(xiàn)死蝦，體格較大螯蝦居多，病死量占養(yǎng)殖產(chǎn)量的39%。采集的發(fā)病螯蝦特征為:蝦體顏色黯淡，胸甲殼有白色斑點，病蝦無力，頭胸甲易剝離，內(nèi)層有軟甲殼，部分螯蝦的螯肢發(fā)育停滯。1.1.2現(xiàn)代生物技術(shù)瓊脂糖;PBS緩沖液;病毒核酸提取試劑盒(Geneaid);PCR擴增引物(購自上海英俊公司);2×TaqMasterMix購自南京東盛生物公司。研磨器，生物安全柜(AIRTECH，蘇凈安泰)，離心機(Eppendorf,centrifuge5415R)，PCR儀(Biometra，華粵行儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，核酸電泳儀(BeiJingJunYi-DongFangelectrophoresisequipmentcompany)。1.2pcr檢測1.2.1研磨、凍融法制備取病蝦鰓絲部分置于玻璃勻漿器中，加入3mLPBS緩沖液、用玻璃勻漿器進行充分研磨。研磨后勻漿液裝于2mLEP管中離心取上清，反復(fù)凍融兩次備用。將凍融后勻漿液按照ViralNucleicAcidExtractionKitII(Geneaid)提取說明書提取病毒DNA，提取后病毒DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr檢測參照OIE(世界動物衛(wèi)生組織)《水生動物疫病診斷手冊》采用25μL體系(12.5μL2×PCRmix，上下游引物各1μL,3μLDNA模板，7.5μLddH2O)，相關(guān)程序為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s、62℃退火30s、72℃30s重復(fù)30個循環(huán)，72℃延伸10min，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。1.3病料離心制備取病蝦鰓部1g病料，加入5mL25%(W/V，蒸餾水配制)蔗糖，勻漿器冰上研磨2-3min破碎細胞。研碎的病料離心取上清，20000×g離心，4℃，1.5h，取沉淀，用適量25%蔗糖溶液重懸。病毒粗提液鋪于不連續(xù)蔗糖密度梯度(32%，46%，52%，62%)4℃超高速離心2h。取各區(qū)間條帶，加適量蒸餾水配成25%的蔗糖濃度，20000×g,4℃，1h，取沉淀用PBS重懸，加磷鎢酸置于銅網(wǎng)上，電鏡(Hitachi,H-7650)負染觀察1.4活佛感染試驗1.4.1致病性實驗實驗感染使用螯蝦，購自南京衛(wèi)崗農(nóng)貿(mào)市場，分為3組，每組35只，平均體重35g，買后置于水族箱，保持室溫26℃-28℃，每天換水50%，通氣培養(yǎng)，暫養(yǎng)7天無異常后，每組30只，作病毒感染實驗。1.4.2除菌、除菌將病蝦去除頭胸甲、肝胰腺、腹肢取頭胸部稱重，與0.01mol/LPBS(pH7.4)1∶5稀釋，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液1000×g離心20min，上清液依次用濾紙和0.45μm濾膜過濾除菌，加入雙抗(青、鏈霉素)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?.4.3肌肉注射種的肌肉注射健康蝦分A,B,C三組，各組各30只，A,B組每只于蝦第1、2腹節(jié)間肌肉注射種毒液0.2mL,C組每只肌肉注射同A組等體積的PBS。連續(xù)飼養(yǎng)9天，每天記錄蝦體發(fā)病死亡情況。1.5感染的來源分析1.5.1淡水化飼料及冷凍飼料發(fā)病養(yǎng)殖場中水草等藻類植物、螺絲、混合養(yǎng)殖的河蟹苗種，水產(chǎn)顆粒膨化飼料，冷凍飼料魚(購于山東省日照市)，以白姑魚和黃花魚為主，混雜海蝦等甲殼類。1.5.2冷凍飼料研磨螺絲和河蟹取臟器于勻漿器中研磨，加入3mLPBS緩沖液、用玻璃勻漿器進行充分研磨。研磨后勻漿液于2mLEP管中離心取上清，凍融兩次備用。冷凍飼料挑取魚鰓樣于玻璃勻漿器中研磨，方法同上。飼料魚中出現(xiàn)的兩尾海蝦單獨取頭部研磨，方法同上。水草和水產(chǎn)顆粒膨化飼料在研缽中研磨，用PBS稀釋，研磨充分后離心取上清。按照ViralNucleicAcidExtractionKitII(Geneaid)提取說明書提取凍融后勻漿液中的病毒DNA，提取后病毒DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5.3pcr檢測采用套式PCR方法檢測，與1.2.2相同。2結(jié)果2.1pcr檢測結(jié)果來自養(yǎng)殖場螯蝦共5批樣品，分別是2010年5月蝦塘大批量死亡受損嚴重的5個養(yǎng)殖塘的螯蝦樣本，每批樣6-8尾螯蝦，取鰓絲研磨，提取上清液作為反應(yīng)模板，套式PCR檢測結(jié)果為陽性(圖1)。2.2尾狀附器及金表面顆粒的面形態(tài)電鏡負染結(jié)果觀察可見白斑綜合征病毒粒子形態(tài):大小在300nm左右，其獨特的尾狀附器(a)和環(huán)狀的核衣殼顆粒(b)清晰可見(圖2)。2.3wssv檢測感染的螯蝦在第2天開始出現(xiàn)精神萎靡，靜臥不動，螯肢及附肢無力等表觀癥狀，在第3天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，感染后第5-7天出現(xiàn)死亡高峰期，癥狀與自然發(fā)病螯蝦相同，病蝦體色暗淡，紅色有褪色感。WSSV檢測陽性。實驗組死亡率分別為90%、93%;對照組3只自然死亡，無異常癥狀，WSSV檢測陰性(圖3)。2.4基因型微生物飼料檢測養(yǎng)殖塘中河蟹苗種、冷凍飼料魚中的海蝦甲殼類、水產(chǎn)顆粒膨化飼料，均檢測出現(xiàn)941bp的特異性目的條帶，結(jié)果為陽性;水塘水，水塘水草，螺絲和冷凍飼料魚樣檢測結(jié)果陰性(圖4)。3水產(chǎn)顆粒膨化飼料自1992年以來，亞洲地區(qū)養(yǎng)殖對蝦陸續(xù)暴發(fā)對蝦白斑綜合征克氏原螯蝦本是較為理想的WSSV的實驗動物模型，用于病毒復(fù)制、藥物篩選等病毒的感染源值得重視。螯蝦養(yǎng)殖一般使用的冷凍飼料魚，混雜海蝦等甲殼類，來源于山東沿海地區(qū)，沿海地區(qū)養(yǎng)殖對蝦曾多次發(fā)生感染W(wǎng)SSV并爆發(fā)流行商品化顆粒膨化飼料中檢出WSSV，之前未見報道。目前使用的水產(chǎn)顆粒膨化飼料一般以當?shù)貋碓吹聂~類、蝦蟹等甲殼動物為原料，水產(chǎn)顆粒膨化飼料的加工工藝已經(jīng)標準化。甲殼類等原料在擠壓膨化工序中，物料通過瞬時(10-30s)、高溫(65℃-80℃)、高濕(25%-32%)膨化，形成膨化飼料。生產(chǎn)中為防止高溫長時間