克氏原螯蝦蝦殼中蝦青素酯的水解工藝研究

克氏原螯蝦蝦殼中蝦青素酯的水解工藝研究

蝦青素主要來(lái)自天然藻類。除少量蝦青素外，大部分蝦青素通過(guò)添加過(guò)量的蝦青素來(lái)芳基苯乙烯和羧基酯形成蝦青素酯，然后與蛋白質(zhì)結(jié)合參與蝦皮合成。脂肪酶是一種甘油酯水解酶,其活性中心三元組中的組氨酸能從絲氨酸上吸收一個(gè)質(zhì)子,使得絲氨酸親核攻擊酯鍵上的碳原子,形成極其不穩(wěn)定的脂肪酶-底物四面體過(guò)渡態(tài),并迅速將底物裂解為脂肪酸和目標(biāo)水解產(chǎn)物試驗(yàn)以克氏原螯蝦蝦殼為原料,以蝦青素提取量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),利用脂肪酶水解蝦青素酯制備蝦青素,重點(diǎn)研究脂肪酶添加量、酶解溫度、溶液pH及酶解時(shí)間等因素對(duì)蝦青素酯水解效果和蝦青素提取量的影響,并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在獲得最佳酶解工藝,為克氏原螯蝦蝦殼的綜合利用提供理論依據(jù)。1材料和機(jī)器1.1蝦青素so文件克氏原螯蝦:由盱眙龍盛龍蝦養(yǎng)殖場(chǎng)提供;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司;脂肪酶(酶活力25730U/g):諾維信;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2儀器和檢測(cè)方法WF180萬(wàn)能粉碎機(jī):上海光學(xué)儀器廠;TU-1900紫外可見分光光度計(jì):北京普析;TDL-40C低速大容量離心機(jī):上海安亭;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮;DX-II恒溫磁力攪拌器:常州諾基;SHZ-D循環(huán)水式真空泵:河南新鄉(xiāng);SPH-211F恒溫振蕩器:上海世平;PHS-3C酸度計(jì):上海雷磁;HH-601恒溫水浴鍋:上海新嘉;JA1003A電子精密天平:上海倫捷。2測(cè)試方法2.1蝦頭、尾及殼的制備新鮮螯蝦沸水煮制2min后自然冷卻,剝除蝦仁和內(nèi)臟,流水洗凈蝦頭、尾及殼,避光、密封于-20℃?zhèn)溆?。試?yàn)前用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后備用。2.2脂肪酶解檸檬準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量粉碎后的蝦殼樣品,按比例加入一定pH的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和脂肪酶,恒溫振蕩酶解一段時(shí)間,酶解結(jié)束后冰水浴冷卻,離心分離取濾渣,反復(fù)水洗去除礦物質(zhì),碾碎后加入丙酮過(guò)夜,過(guò)濾后留上清液,丙酮定容至50mL2.3提取蝦青素的測(cè)定2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取0,0.50,1.00,1.50,2.00和2.50mL1.0mg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中,丙酮定容至50mL,混合均勻后在478nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。由圖1可知,蝦青素在0~50μg/mL范圍內(nèi)線性回歸方程y=0.0086x-0.0063,相關(guān)系數(shù)為0.9993,結(jié)果符合朗伯比爾定律,方程可用于蝦青素提取量的測(cè)定。2.3.2樣品測(cè)定吸取1.0mL丙酮溶解液置于50mL比色管中,按照2.3.1測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蝦殼提取液中蝦青素提取量。2.4脂肪酶分解條件的選擇2.4.1脂肪酶添加量對(duì)蝦青素酯水解效果的影響準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0g,分別加入pH為5.0的緩沖溶液100mL,再分別加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6和0.7g脂肪酶(加酶量分別為2%,4%,6%,8%,10%,12%和14%),然后置于50℃的恒溫振蕩器中酶解5h,酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行分離、除雜和定容,并根據(jù)2.3進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定,以蝦青素提取量為指標(biāo)考察脂肪酶添加量對(duì)蝦青素酯水解效果的影響。2.4.2酶解溫度對(duì)蝦青素酯水解效果的影響準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0g,分別加入pH為5.0的緩沖溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后分別置于20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃和80℃的恒溫振蕩器中酶解5h,酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行分離、除雜和定容,并根據(jù)2.3進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定,以蝦青素提取量為指標(biāo)考察酶解溫度對(duì)蝦青素酯水解效果的影響。2.4.3溶液ph對(duì)蝦青素酯水解效果的影響準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0g,依次加入pH為4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5和7.0的緩沖溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后置于50℃的恒溫振蕩器中酶解5h,酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行分離、除雜和定容,并根據(jù)2.3進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定,以蝦青素提取量為指標(biāo)考察溶液pH對(duì)蝦青素酯水解效果的影響。2.4.4酶解時(shí)間對(duì)蝦青素酯水解效果的影響準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0g,分別加入pH為5.5的緩沖溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后置于55℃的恒溫振蕩器中分別酶解1,2,3,4,5,6和7h,酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行分離、除雜和定容,并根據(jù)2.3進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定,以蝦青素提取量為指標(biāo)考察酶解時(shí)間對(duì)蝦青素酯水解效果的影響。2.5最佳酶分解條件的確定在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以脂肪酶添加量、酶解溫度、溶液pH及酶解時(shí)間為因素,采用L3結(jié)果與分析3.1蝦青素酯酶分解條件的選擇3.1.1酶添加量的影響由圖2可知,蝦青素提取量隨脂肪酶添加量的增大先快速增加,后趨于平緩。這主要是因?yàn)槊附馑俣炔粌H取決于水解速度,還受酶活性中心與底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合速度的影響。當(dāng)?shù)孜锍渥愣久柑砑恿枯^少時(shí),酶分子通過(guò)較小距離的運(yùn)動(dòng)即可快速接觸到底物結(jié)合位點(diǎn),并迅速發(fā)生水解反應(yīng),因此反應(yīng)速度很快;再少量添加酶,在底物仍然充足的情況下,底物與酶結(jié)合位點(diǎn)也成比例增加,因此速度基本呈線性增加;而當(dāng)酶添加量過(guò)多時(shí),底物結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和,再添加多余的酶也不能與底物結(jié)合,因此也不會(huì)產(chǎn)生酶解速度的增加。由此可見,脂肪酶添加量以10%為宜。3.1.2溫度對(duì)蝦青素提取的影響由圖3可知,在20℃~50℃范圍內(nèi),隨著酶解溫度的提高,蝦青素提取量快速增加,這主要是因?yàn)闇囟鹊脑黾硬粌H能加快底物和酶分子運(yùn)動(dòng)速度,增加酶活性中心與底物結(jié)合中心接觸的幾率,而且還能促進(jìn)脂肪酶-底物四面體過(guò)渡態(tài)的快速解離3.1.3ph對(duì)脂肪酶活性的影響由圖4可知,隨著溶液pH的增加,蝦青素提取量先快速增加后緩慢降低,并在pH接近5.5時(shí)達(dá)到最大值(80.52μg/g),這主要是因?yàn)橹久笧槿跛嵝悦割?最適pH為5.5~6.0,在該pH范圍內(nèi),酶分子和底物分子均處于最佳電離狀態(tài),有利于二者的結(jié)合和催化反應(yīng)的進(jìn)行;當(dāng)pH小于5.5或大于6.5時(shí),溶液中過(guò)多的H3.1.4脂肪酶-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)特征由圖5可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蝦青素提取量先快速增加,后趨于平緩。這可能是因?yàn)橹久傅拇呋钚灾行牟课槐灰粋€(gè)或多個(gè)α-螺旋片段遮蓋(稱為“蓋子”結(jié)構(gòu)),當(dāng)脂肪酶處于油水兩相界面時(shí),蓋子結(jié)構(gòu)打開,活性中心露出,并深入油相界面與底物酯鍵結(jié)合形成脂肪酶-底物四面體過(guò)渡態(tài),然后再快速分解為脂肪酸和產(chǎn)物3.2各因素作用的回歸分析采用極差法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行分析,以各因素的水平為橫坐標(biāo),k值為縱坐標(biāo)繪制各因素作用的直觀分析圖(見圖6)。由表2中R值可以看出,各因素對(duì)結(jié)果的影響次序?yàn)镈>A>C>B,即酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取量的影響最大,脂肪酶添加量次之,酶解溫度對(duì)蝦青素提取量的影響最小。由表2中蝦青素提取量水平對(duì)應(yīng)的k值和圖6中曲線的形狀可以看出,試驗(yàn)的最佳組合A3.3蝦青素提取量測(cè)定因?yàn)锳由表3可知,在設(shè)定的酶解條件下,蝦青素提取量較高(87.58μg/g)且穩(wěn)定,平均得率超過(guò)正交試驗(yàn)最大值,具有可行性和實(shí)用價(jià)值。4