高效液相色譜法測(cè)定不同濃度的多環(huán)芳烴

高效液相色譜法測(cè)定不同濃度的多環(huán)芳烴

作為一種強(qiáng)致癌性化合物，多環(huán)芳烴（pahs）主要來(lái)源于非復(fù)發(fā)或過(guò)度食用的正常食用油。目前建立的食用油中單一或多個(gè)PAHs的快速篩查方法主要涉及兩方面內(nèi)容：前處理方法和儀器分析方法。儀器分析方法包括液相色譜-熒光檢測(cè)法（LC-FLD）、氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)法（GC-FID）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）等目前，脂肪酶酶解技術(shù)主要應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)成分分析，如脂肪酸及各種維生素的檢測(cè)，在食品添加劑及有毒有害物質(zhì)檢測(cè)方面應(yīng)用甚少。本工作根據(jù)這4種PAHs的多環(huán)結(jié)構(gòu)和食用油基質(zhì)中高脂肪含量的特點(diǎn)，前處理采用專(zhuān)一性酶解法處理樣品，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）對(duì)樣品提取液中BaA、BbF、BkF和BaF等4種PAHs的含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為提高政府監(jiān)管部門(mén)的監(jiān)管工作效率，保證食品安全提供了基礎(chǔ)。1試驗(yàn)部分1.1單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制LC-20AT型高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器；Milli-Q型高純水發(fā)生器；SF-40R型冷凍離心機(jī)；TKA型漩渦振動(dòng)器；Hei-VAPExpert型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋；0.22μm尼龍濾膜。單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：取0.01g單標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至10mL的容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到1.0g·L磷酸鹽緩沖溶液：0.108g·mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取4種PAHs的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各10μL，用乙腈定容至10.0mL，配制成1.0mg·L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：稱(chēng)取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋至刻度，配制0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0μg·LBaA、BbF、BkF和BaF的純度不小于95%；脂肪酶的酶活性大于700U·mg正己烷、乙腈、二氯甲烷、乙醇均為色譜純；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率18.2ΩM·cm）。動(dòng)物油、植物油和煎炸油等3種常見(jiàn)食用油來(lái)自國(guó)家殘留監(jiān)控抽樣和進(jìn)出口送檢企業(yè)。1.2顯示工作條件1.3脂肪酶解碳酸鉀3g稱(chēng)取2.0g樣品，依次加入5mL磷酸鹽緩沖溶液（pH8.0）和0.2g脂肪酶，恒溫（37±2）℃振蕩酶解2h。加入1.0g碳酸鉀，5mL乙醇，渦旋混勻。在提取溶液中加入15mL正己烷，5mL水，振蕩5min，以4500r·min2結(jié)果與討論2.1鉻行為按照儀器工作條件，對(duì)5.0μg·L2.2脂肪酶用量及酶解時(shí)間對(duì)殘余油脂除油率的影響針對(duì)食用油特殊基質(zhì)成分和4種PAHs的弱極性性質(zhì)，試驗(yàn)采用專(zhuān)一性脂肪酶處理樣品，緩沖溶液選擇磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH8.0），整個(gè)酶解過(guò)程溫度控制在（37±2）℃，此條件可以在保證酶活性的同時(shí)，又可以降低基質(zhì)中脂肪的干擾。皂化反應(yīng)經(jīng)常用來(lái)去除油脂，其通常在濃堿環(huán)境下進(jìn)行（氫氧化鉀或氫氧化鈉等強(qiáng)堿性化合物），但在此環(huán)境中，待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)極易被破壞，且有機(jī)相中殘留的強(qiáng)堿性化合物需多次水洗才可以消除，不可避免的造成待測(cè)化合物的損失、檢測(cè)時(shí)間的加長(zhǎng)和檢測(cè)成本的增加。因此，本工作采用碳酸鉀進(jìn)行皂化反應(yīng)，碳酸鉀不僅可以提供弱堿性環(huán)境和終止酶解反應(yīng)，還可以皂化油脂，確保最大的除油率，除油率（X）可通過(guò)測(cè)量氮吹充分后殘余油脂的精確質(zhì)量值計(jì)算：式中：m脂肪酶用量以及酶解時(shí)間都與除油率相關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)考察了脂肪酶用量分別為0.05,0.1,0.2,0.5,1.0g，酶解時(shí)間分別為1.0,2.0,3.0,5.0h時(shí)對(duì)動(dòng)物油、植物油和經(jīng)用于煎炸的食用油（煎炸油）等3種常見(jiàn)食用油除油率的影響。由圖2可知：當(dāng)脂肪酶用量為0.05g和0.1g時(shí)，除油率受酶解時(shí)間影響較大，此時(shí)，酶解時(shí)間大于等于2.0h的除油率較1.0h的明顯增加，但均低于80%；當(dāng)脂肪酶用量大于0.1g時(shí)，酶解時(shí)間2.0h的除油率明顯高于1.0h的，但2.0,3.0,5.0h的除油率差別很小。從節(jié)約時(shí)間和成本的角度出發(fā)，試驗(yàn)選擇脂肪酶用量為0.2g，酶解時(shí)間為2.0h。試驗(yàn)還考察了碳酸鉀用量分別為0,0.5,1.0,2.0g時(shí)對(duì)除油率的影響。由圖3可知：當(dāng)碳酸鉀的用量不大于1.0g時(shí)，除油率隨著碳酸鉀用量的增加而增加；當(dāng)碳酸鉀用量為1.0g時(shí)，除油率達(dá)到最大區(qū)間（98.1%～99.8%）；碳酸鉀用量為2.0g時(shí)，除油率反而降低，推測(cè)可能是由于過(guò)量的碳酸鉀造成了過(guò)堿環(huán)境，破壞了酶的活性進(jìn)而降低了除油效率。因此，試驗(yàn)選擇碳酸鉀的用量為1.0g。2.3影響較大較萃取前，在待皂化的樣品溶液中加入適量乙醇可以有效防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生，此外，乙醇還能起到預(yù)萃取的作用。同時(shí)，4種PAHs屬于弱極性化合物，萃取劑正己烷的用量對(duì)其回收率的影響較大。因此，試驗(yàn)考察了乙醇用量分別為2.5,5,10,15mL，正己烷用量分別為15,30,45mL時(shí)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加量為0.1μg·kg由表2～表5結(jié)果可知：正己烷用量為15mL時(shí)，4種PAHs的回收率較低，均低于77%；當(dāng)正己烷用量為30mL和45mL時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定，均能達(dá)到90%以上。當(dāng)乙醇用量不小于5mL時(shí)，4種PAHs回收率相差不大，而乙醇用量為5mL時(shí)即可保持液-液界面清晰消除乳化現(xiàn)象。從節(jié)約濃縮時(shí)間和成本的角度出發(fā)，試驗(yàn)選擇的乙醇用量為5mL，正己烷用量為30mL。2.4流動(dòng)相的影響采用液相色譜檢測(cè)目標(biāo)化合物時(shí)，經(jīng)常在流動(dòng)相中加入緩沖鹽以增加儀器的響應(yīng)靈敏度，但緩沖鹽的大量長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)儀器造成損害。試驗(yàn)考察了分別以甲醇-水和乙腈-水體系作流動(dòng)相時(shí)對(duì)4種PAHs的色譜行為的影響。結(jié)果表明：乙腈-水體系柱壓更低、安全性好，所以，試驗(yàn)選擇乙腈-水體系為流動(dòng)相，通過(guò)對(duì)其梯度洗脫條件的優(yōu)化，得到了合適的保留時(shí)間、峰形及分離效果。另外，試驗(yàn)還對(duì)DikmaPlusC2.5儀器響應(yīng)值、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度是標(biāo)準(zhǔn)曲線按照試驗(yàn)方法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間定性、外標(biāo)法定量。以4種PAHs的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的儀器響應(yīng)值（響應(yīng)值=標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。4種PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.1～5.0μg·L以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算檢出限（3S/N）和測(cè)定下限（10S/N），結(jié)果見(jiàn)表6。2.6所適用的回收率在3種常見(jiàn)食用油中進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知：4種PAHs的回收率為90.4%～99.9%,RSD均在10%以內(nèi)，說(shuō)明本方法對(duì)這3種食用油均具有較強(qiáng)的適用性，可實(shí)現(xiàn)